ロイコロディウム。 公表特許公報(A)_高光合成生物

2010年07月31日のテレビ番組表(全国・CS2・アニメ)

ロイコロディウム

それぞれの開示は、全ての目的のために参照により本明細書に組み入れられる。 分野 本発明は合成生物学の分野に関し、さらに具体的には、二酸化炭素および光をバイオマスおよび関心対象の炭素ベース産物に効率的に変換するように設計された、産業化された光独立栄養生物に関する。 背景 光合成とは、生物学的実体がエネルギーを得るために太陽光およびCO2を利用して糖を産生するプロセスである。 既存の光独立栄養生物 すなわち、植物、藻類、および光合成細菌 は工業バイオプロセスにあまり適していない。 特に、ほとんどの生物の倍加時間 10〜72時間 は、大腸菌(Escherichia coli)などの産業化された従属栄養生物 20分 と比較して長い。 さらに、光独立栄養生物は、多くの場合、pH、温度、および耐塩性を含む一般的な環境ストレスにおいて中程度の変化を受けやすい。 このような感受性があるために、光独立栄養体を産業に使用するのは効率が悪い。 さらに、ますます毒性が強くなってきている環境要因 例えば、重金属、窒素、および硫黄をベースとする工業副産物を含む毒性汚染物質 のために、光独立栄養体の特定の工業用途への適用はさらに限定されることがある。 微生物において潜在的に産生することができる望ましい産物 例えば、操作された大腸菌において産生されるエタノールおよび他の高級分枝アルコール Atsumi, et al. Nature 2008 vol451:86-90(非特許文献1) は、光独立栄養体では産生代謝経路が適合しないかもしくは不十分なために、または必要な、細胞に基づく生体触媒が全く存在しないために処理しにくいことが見出されている。 従って、当技術分野において、工業バイオプロセスにより適した、改善された光独立栄養生物が必要とされる。 Atsumi, et al. Nature 2008 vol451:86-90概要 本発明は、例えば、光捕獲および炭素固定の効率を遺伝的に改善することによって、ならびにフォトバイオリアクター内で増やすための増殖特性を最適化することによって、光合成生物を安定して利用する経路を操作するための方法および組成物を提供する。 本発明はまた、結果として生じた、二酸化炭素および光を関心対象の炭素ベース産物を効率的に変換する操作された「高光合成」細胞および生物を提供する。 光捕獲核酸、二酸化炭素固定経路核酸、NADH経路核酸、NADPH経路核酸、耐熱性核酸、pH耐性核酸、煙道ガス耐性核酸、耐塩性核酸、栄養分非依存性核酸、および近赤外光吸収核酸からなる群より選択される少なくとも1つの操作された核酸を含み、前記の操作された核酸によってコードされる異種タンパク質を発現するか、前記の操作された核酸の存在の結果として内因性タンパク質を過剰発現するか、前記の操作された核酸の存在の結果として内因性タンパク質を下方制御するか、または前記の操作された核酸の存在の結果として遺伝子がノックアウトされている、操作された光合成細胞が、本明細書において提供される。 本明細書では、複数の操作された光捕獲核酸、二酸化炭素固定経路核酸、NADH経路核酸、NADPH経路核酸、耐熱性核酸、pH耐性核酸、煙道ガス耐性核酸、耐塩性核酸、栄養分非依存性核酸、および近赤外光吸収核酸を含む、操作された細胞も提供される。 本発明はまた、3-ヒドロキシプロピオン酸回路タンパク質、カルビン回路タンパク質、炭素-アセチル-CoAフラックスタンパク質、 糖新生経路タンパク質、グリオキシル酸シャント経路タンパク質、ピルビン酸合成経路タンパク質、還元的TCA回路タンパク質、およびウッド-ユングダール Woods-Ljungdahl 経路タンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質をコードする操作された炭素固定経路核酸を含む、操作された光合成細胞を提供する。 本発明はまた、ベタイン生合成タンパク質;光化学系安定化タンパク質および修復タンパク質;ならびにタンパク質フォールディングタンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質をコードする操作された耐熱性核酸を含む、操作された光合成細胞を提供する。 さらに、本発明は、NOx耐性タンパク質、SOx耐性タンパク質、水銀耐性タンパク質、金属耐性タンパク質、および粒子エアロゾル耐性タンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質をコードする操作された煙道ガス耐性核酸を含む、操作された光合成細胞をさらに提供する。 さらに別の態様において、本発明は、クロロフィルd生合成核酸を含む操作された近赤外光吸収核酸を含む、操作された光合成細胞を提供する。 本発明の様々な態様において、操作された核酸は、操作された細胞によって発現される異種タンパク質をコードするか、操作された細胞内で内因性タンパク質の過剰発現を引き起こすか、操作された細胞内で内因性タンパク質のダウンレギュレーションを引き起こすか、または操作された細胞内で遺伝子ノックアウトを引き起こす。 本発明の別の局面において、操作された細胞は、バイオマス、関心対象の炭素ベース産物、または薬学的薬剤を産生するのに用いられる。 さらに他の態様では、本発明は、耐熱性核酸、pH耐性核酸、煙道ガス耐性核酸、耐塩性核酸、栄養分非依存性核酸、および近赤外光吸収核酸からなる群より選択される少なくとも1つの操作された核酸を含み、前記の操作された核酸によってコードされる異種タンパク質を発現するか、前記の操作された核酸の存在の結果として内因性タンパク質を過剰発現するか、前記の操作された核酸の存在の結果として内因性タンパク質を下方制御するか、前記の操作された核酸の存在の結果として遺伝子がノックアウトされている、操作された炭素固定細胞を提供する。 本発明のある特定の態様において、操作された細胞は、独立栄養細胞である。 ある特定の他の態様において、操作された細胞は、光独立栄養細胞である。 本発明の様々な態様において、操作された細胞は、植物、原核生物、真核生物、酵母、糸状菌、原生動物、藻類および合成細胞からなる群より選択される。 関心対象の炭素ベース産物を産生する方法も開示される。 前記方法は、a 光捕獲核酸、二酸化炭素固定経路核酸、NADH経路核酸、NADPH経路核酸、耐熱性核酸、pH耐性核酸、煙道ガス耐性核酸、耐塩性核酸、栄養分非依存性核酸、および近赤外光吸収核酸からなる群より選択される少なくとも1つの操作された核酸を発現するように、細胞を操作する工程であって;b 前記細胞が、前記の操作された核酸によってコードされる異種タンパク質を発現する工程、前記の操作された核酸の存在の結果として内因性タンパク質を過剰発現する工程、前記の操作された核酸の存在の結果として内因性タンパク質を下方制御する工程、または前記の操作された核酸の存在の結果として遺伝子がノックアウトされる工程;ならびにc CO2および光の存在下で前記細胞を培養して、関心対象の炭素ベース産物を産生する工程を含む。 本発明の様々なモジュールの操作に関連して発現または上方制御することができる遺伝子を特定する表1を提供する。 本発明の様々なモジュールの操作に関連して下方制御またはノックアウトすることができる遺伝子を特定する表2を提供する。 クロロフィルa Chl a からのクロロフィルd Chl d 誘導の合成スキームを提供する。 簡単にするために、Chl前駆体であるクロロフィリドを図に示した。 エポキシドヒドロラーゼ検索のクエリー配列を提供する。 マリナゲノムのオキシゲナーゼをコードする遺伝子として同定された遺伝子を列挙する表3を提供する。 マリナゲノムのオキシゲナーゼをコードする遺伝子として同定された遺伝子を列挙する表3を提供する。 マリナゲノムのオキシゲナーゼをコードする遺伝子として同定された遺伝子を列挙する表3を提供する。 マリナゲノムのエポキシド還元酵素をコードする遺伝子として同定された遺伝子を列挙する表4を提供する。 マリナゲノムのSAM利用オキシゲナーゼをコードする遺伝子として同定された遺伝子を列挙する表5を提供する。 マリナゲノムの光化学系タンパク質をコードする遺伝子として同定された遺伝子を列挙する表6を提供する。 図10は、トランスジェニックシネココッカス属の種PCC7002株:JCC1-UdhA レーン2および3 ;JCC1-ZWF レーン4 ;ならびにJCC1-SAR86 レーン5 のPCR確認を示したアガロースゲルの写真である。 図10Bは、JCC136からのPCR産物を示したアガロースゲルの写真である。 シネココッカス属の種PCC7002株JCC136およびJCC136-FbpIにおける、時間の関数としてのエタノール産生 左 およびエタノール:OD比 右 のグラフを示す。 配列表 添付の配列表に列挙したアミノ酸配列は、37C. 822において定義されたアミノ酸残基の標準的な文字略語を用いて示した。 添付のアミノ酸配列表。 略語および用語 用語および方法の以下の説明は、本発明の開示をより詳しく説明するために、かつ本開示の実施において当業者を案内するために提供される。 本明細書で使用する「含む comprising 」は「含む including 」を意味し、単数形「1つの a 」もしくは「1つの an 」または「その the 」は、特に文脈によってはっきり規定されていない限り複数の指示物を含む。 例えば、「細胞を含む comprising a cell 」についての言及は、1つまたは複数のこのような細胞を含み、「チオエステラーゼを含む comprising a thioesterase 」についての言及は、1つのまたは複数のチオエステラーゼペプチドおよび当業者に公知のその均等物についての言及を含む。 「または or 」という用語は、特に文脈によってはっきり規定されていない限り、述べられた複数の代替要素の中の1つの要素、または2つもしくはそれ以上の要素の組み合わせを指す。 特に説明のない限り、本明細書において使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。 本明細書に記載の方法および材料に類似するまたは均等な任意の方法および材料を、本開示の実施または試験において使用することができるが、適切な方法および材料を下記で説明する。 材料、方法、および実施例は単なる例示であり、限定を目的としない。 本開示の他の特徴は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。 アクセッション番号:本説明全体を通じてアクセッション番号は、以下のデータベース:NCBI National Center for Biotechnology Information 、TIGR The Institute for Genomic Research 、およびKEGG Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes において見出されるものに対応する。 アクセッション番号は、2007年11月10日にデータベースに提供されたものである。 酵素分類番号 EC :本説明全体を通じて提供されるEC番号は、京都大学が一部出資している、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomeicsが管理している、KEGGリガンドデータベースから得たものである。 EC番号は、2007年11月10日にデータベースに提供されたものである。 DNA:デオキシリボ核酸。 DNAは、ほとんどの生物の遺伝物質を含む長鎖ポリマーである 一部のウイルスは、リボ核酸、RNAを含む遺伝子を有する。 DNAポリマー中の反復単位は4種類のヌクレオチドであり、これらはそれぞれ、リン酸基が付着しているデオキシリボース糖に結合した、4種類の塩基アデニン、グアニン、シトシン、およびチミンのうちの1つを含む。 コドン:DNA分子中のヌクレオチドトリプレットはコドンと呼ばれ、ペプチドのアミノ酸をコードする。 コドンという用語は、DNA配列が転写されたmRNA中の、3つのヌクレオチドからなる対応する および相補する 配列についても用いられる。 内因性:核酸分子および特定の細胞または微生物に関して本明細書で使用する場合、細胞内にあり、組換え操作法を用いて細胞に導入されていない、核酸配列またはペプチドを指す。 例えば、細胞が自然から最初に単離された時に細胞に存在する遺伝子は、内因性であるとみなされる。 制御配列、例えば、転写または翻訳を活性化するプロモーター配列またはエンハンサー配列が組換え法によって変えられていても、遺伝子は依然として内因性であるとみなされる。 外因性:核酸分子および特定の細胞または微生物に関して本明細書で使用する場合、細胞が自然から最初に単離された時に細胞に存在しない核酸配列またはペプチドを指す。 例えば、異なる微生物に由来し、組換えDNA法または他の核酸送達法を用いて別の細胞に入るように操作された核酸は、外因性であるとみなされる。 発現:遺伝子がコードしている情報が、細胞の構造および機能を支持する分子、例えば、タンパク質、トランスファーRNA、またはリボソームRNAに変換されるプロセス。 発現された遺伝子には、mRNAに転写され、次いで、タンパク質に翻訳された遺伝子、およびRNAに転写されるが、タンパク質に翻訳されない遺伝子 例えば、トランスファーRNAおよびリボソームRNA が含まれる。 過剰発現:過剰発現は、遺伝子が、その遺伝子の内因性転写速度と比較して速い速度で転写される任意の状態を指す。 一部の例では、過剰発現は、その遺伝子の内因性翻訳速度と比較して速い遺伝子翻訳速度をさらに含む。 過剰発現を試験する方法は当技術分野において周知である。 例えば、転写RNAレベルは、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応 RT-PCR を用いて評価することができ、タンパク質レベルは、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動 SDS-PAGE 分析を用いて評価することができる。 さらに、遺伝子は、内因活性と比較して高い活性を示す時に過剰発現しているとみなされ、これは、例えば、遺伝子のインヒビターの濃度もしくは活性の減少によって、または高活性を有する変異体バージョンの発現によって起こり得る。 好ましい態様において、宿主細胞が、望ましい生化学的活性を有する内因性遺伝子をコードする場合、外因性遺伝子を過剰発現させることが有用であり、これにより、バイオプロセスにおいてより明確な調節制御、および天然遺伝子に明確に焦点を合わせた、中心代謝調節の影響を潜在的に緩和する手段が可能になる。 ダウンレギュレーション:ダウンレギュレーションは、遺伝子が、その遺伝子の内因性転写速度と比較して遅い速度で転写される任意の状態を指す。 ある特定の態様において、遺伝子発現は、核酸、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、二本鎖RNA、低分子干渉RNA、低分子ヘアピン型RNA、ミクロRNA、リボザイムなどの発現によって下方制御される。 一部の例では、ダウンレギュレーションは、その遺伝子の内因性翻訳速度と比較して遅い遺伝子翻訳レベルをさらに含む。 さらに、遺伝子は、内因性活性と比較して低い活性を示す時に下方制御されているとみなされ、これは、例えば、遺伝子のインヒビターの濃度もしくは活性の増加によって、または低活性を有する変異体バージョンの発現によって起こり得る。 ダウンレギュレーションを試験する方法は当業者に周知であり、例えば、転写RNAレベルはRT-PCRを用いて評価することができ、タンパク質レベルはSDS-PAGE分析を用いて評価することができる。 ノックアウト:発現レベルまたは活性レベルが0まで減少している遺伝子。 一部の例では、遺伝子は、そのコード配列の一部または全てを欠失または置換することによってノックアウトされる。 他の例では、遺伝子は、1つまたは複数のヌクレオチドをそのオープンリーディングフレームに導入するか、1つまたは複数のヌクレオチドを除去して、ナンセンスタンパク質産物または他の方法で機能しないタンパク質産物が翻訳されることによってノックアウトされる。 独立栄養体:独立栄養体 または独立栄養生物 は、単純な無機分子および外部エネルギー源、例えば、光 光独立栄養体 または無機化合物の化学反応から複雑な有機化合物を産生する生物である。 従属栄養体:従属栄養体 または従属栄養生物 は独立栄養体と異なり、光または無機化学反応から直接エネルギーを得ることができず、そのため有機炭素基質を食べなければならない生物である。 従属栄養体は、摂取した有機分子を分解することによって化学エネルギーを得る。 従属栄養体には、動物、菌類、および非常に多くのタイプの細菌が含まれる。 高光合成細胞はまた、1つまたは複数の機能改善を実現するように進化または変異誘発されている、前記のように操作された細胞または生物を含む。 炭化水素:概して、元素炭素 C 、任意に、酸素 O および水素 H からなる化合物を指す。 生合成経路:「代謝経路」とも呼ばれ、ある化学種を別の化学種に変換 変形 するための一組の同化または異化の生化学的反応を指す。 同化経路は小さな分子から大きな分子の構築を伴い、エネルギーを必要とするプロセスである。 異化経路は大きな分子の分解を伴い、多くの場合、エネルギーを放出する。 セルロースは植物の主な構造成分であり、ヒトは消化することができない。 セルロースは植物細胞壁内のありふれた材料であり、1838年にこのようなものとして最初に述べられた。 ほぼ純粋な形をしたセルロースは天然では綿繊維でしか見られない。 セルロースはリグニンおよび任意のヘミセルロースと組み合わせて、全ての植物材料において見出される。 界面活性剤:界面活性剤は、界面活性剤が溶解している液体の表面張力を小さくすることができる物質である。 界面活性剤は、典型的には、水溶性の頭部と炭化水素の鎖および尾部からなる。 水溶性基は親水性であり、イオン性または非イオン性のいずれでもよく、炭化水素鎖は疎水性である。 バイオ燃料:バイオ燃料は、生物学的供給源に由来する任意の燃料である。 操作された核酸:「操作された核酸」は、天然の核酸分子と少なくとも1つの相違点を含む核酸分子である。 操作された核酸には、改変された、または改変されていない全ての外因性異種配列 すなわち、操作された核酸を有する生物または細胞以外の生物または細胞から得られた配列 、ならびに天然配列と比較して改変されている、変異しているか、欠失または挿入を含む、内因性遺伝子、オペロン、コード配列、または非コード配列が含まれる。 操作された核酸は、起源に関係なく、天然には関連しない誘導性プロモーターまたは別の制御配列に連結した全ての配列も含む。 操作された核酸は、内因性遺伝子の発現を下方制御またはノックアウトするのに使用することができる全ての配列をさらに含む。 これらには、アンチセンス分子、RNAi分子、相同組換えを生じる構築物、cre-lox構築物などが含まれる。 光捕獲核酸:「光捕獲核酸」は、単独でまたは別の核酸と組み合わせて、光エネルギー すなわち、光子 を、化学エネルギー、例えば、プロトン勾配、還元力、または少なくとも1つの高エネルギーリン酸結合を含有する分子、例えば、ATPもしくはGTPに変換する1つもしくは複数のタンパク質をコードする核酸を指す。 例示的な光捕獲核酸には、光活性化プロトンポンプ、例えば、ロドプシン、キサントロドプシン、プロテオロドプシン、およびバクテリオロドプシンをコードする核酸、ならびに集光性捕獲効率を直接調節するタンパク質 集光性複合体、LHCIおよびLHCII または間接的に調節するタンパク質 切断型集光性アンテナ、tla1 をコードする核酸が含まれる。 光捕獲核酸には、発現すると光捕獲が低下する1つまたは複数の内因性遺伝子の発現を減らす、またはノックアウトするのに用いられる核酸がさらに含まれる。 二酸化炭素固定経路核酸:「二酸化炭素固定経路核酸」は、単独でまたは別の核酸と組み合わせて、独立栄養炭素固定を可能にするタンパク質をコードする核酸を指す。 二酸化炭素固定経路核酸にはまた、炭素フラックスを、効率的な増殖または炭素ベース産物形成に必要とされる重要な細胞中間体、例えば、アセチル-CoAに向ける核酸も含まれる。 二酸化炭素固定経路核酸には、発現すると二酸化炭素固定が低下する1つまたは複数の内因性遺伝子の発現を減らす、またはノックアウトするのに用いられる核酸がさらに含まれる。 NADH経路核酸:「NADH経路核酸」は、単独でまたは別の核酸と組み合わせて、炭素固定を行うための還元型NADの適切にバランスのとれた供給を維持するタンパク質をコードする核酸を指す。 NADH経路核酸には、発現すると、炭素固定および他の必要な生物学的プロセスを行うための還元型NADの適切にバランスのとれた供給の維持が損なわれる、1つまたは複数の内因性遺伝子の発現を減らす、またはノックアウトするのに用いられる核酸がさらに含まれる。 NADPH経路核酸:「NADPH経路核酸」は、単独でまたは別の核酸と組み合わせて、炭素固定を行うための還元型NADPHの適切にバランスのとれた供給を維持するタンパク質をコードする核酸を指す。 例示的なNADPH経路核酸には、ホスホグルコノラクトナーゼおよび可溶性ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼをコードする核酸が含まれる。 NADPH経路核酸には、発現すると、炭素固定および他の必要な生物学的プロセスを行うための還元型NADPの適切にバランスのとれた供給の維持が損なわれる、1つまたは複数の内因性遺伝子の発現を減らす、またはノックアウトするのに用いられる核酸がさらに含まれる。 耐熱性核酸:「耐熱性核酸」は、単独でまたは別の核酸と組み合わせて、過剰発現、ダウンレギュレーション、または阻害されると耐熱性が高まるタンパク質をコードする核酸を指す。 耐熱性核酸には、発現すると耐熱性が損なわれる1つまたは複数の内因性遺伝子の発現を減らす、またはノックアウトするのに用いられる核酸がさらに含まれる。 pH耐性核酸:「pH耐性核酸」は、単独でまたは別の核酸と組み合わせて、過剰発現、ダウンレギュレーション、または阻害されると、高pHまたは低pHでの増殖が可能になるタンパク質をコードする核酸を指す。 例示的なpH耐性核酸には、グルタミン酸デカルボキシラーゼおよびスーパーオキシドジスムターゼをコードする核酸が含まれる。 pH耐性核酸には、発現するとpH耐性が損なわれる1つまたは複数の内因性遺伝子の発現を減らす、またはノックアウトするのに用いられる核酸がさらに含まれる。 煙道ガス耐性:「煙道ガス耐性核酸」は、単独でまたは別の核酸と組み合わせて、過剰発現、ダウンレギュレーション、または阻害されると、二酸化炭素、SOx、NOx、およびN2を含む煙道ガス成分の存在下での増殖が可能になるタンパク質をコードする核酸を指す。 例示的な煙道ガス耐性核酸には、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、システイン合成酵素、およびNirKをコードする核酸が含まれる。 煙道ガス耐性核酸には、発現すると煙道ガス耐性が損なわれる1つまたは複数の内因性遺伝子の発現を減らす、またはノックアウトするのに用いられる核酸がさらに含まれる。 栄養分非依存性核酸:「栄養分非依存性核酸」は、単独でまたは別の核酸と組み合わせて、過剰発現、ダウンレギュレーション、または阻害されると、外因性栄養分の非存在下で、または低濃度の外因性栄養分の下での繁殖を可能にするタンパク質をコードする核酸を指す。 例示的な栄養分非依存性核酸には、MetEおよびNrdBをコードする核酸が含まれる。 栄養分非依存性遺伝子には、発現すると、外因性栄養分の非存在下で、または低濃度の外因性栄養分の下での繁殖が損なわれる1つまたは複数の内因性遺伝子の発現を減らす、またはノックアウトするのに用いられる核酸がさらに含まれる。 耐塩性核酸:「耐塩性核酸」は、単独でまたは別の核酸と組み合わせて、過剰発現、ダウンレギュレーション、または阻害されると高塩分の条件下で、例えば、海水中での繁殖が可能になるタンパク質をコードする核酸を指す。 アセチル-CoAフラックス核酸:「アセチル-CoAフラックス核酸」は、単独でまたは別の核酸と組み合わせて、過剰発現、ダウンレギュレーション、または阻害されると単位時間に産生されるアセチル-CoAが増加するタンパク質をコードする核酸を指す。 過剰発現され得る例示的な核酸には、パントテン酸キナーゼおよびピルビン酸デヒドロゲナーゼが含まれる。 下方制御、阻害、またはノックアウトされ得る核酸には、アシルコエンザイムAデヒドロゲナーゼ、生合成グリセロール3-リン酸デヒドロゲナーゼ、および乳酸デヒドロゲナーゼが含まれる。 クロロフィルd核酸:「クロロフィルd核酸」は、単独でまたは別の核酸と組み合わせて、過剰発現、ダウンレギュレーション、または阻害されると、クロロフィルdが生合成され、反応中心である光化学系 PS IおよびPSIIに組み込まれるタンパク質をコードする核酸を指す。 または、クロロフィルd核酸は、光捕獲のためにクロロフィルdを使用する生物が繁殖できるように、照明に用いられる人工光の波長が選択された条件下での繁殖を可能にする。 配列同一性:2つまたはそれ以上の核酸配列またはポリペプチド配列の状況での「同一の」またはパーセント「同一性」という用語は、BLASTもしくはBLAST2. 0配列比較アルゴリズムと下記のデフォルトパラメータを用いて、または手作業によるアラインメントおよび目視検査によって測定された時に、同じであるか、または特定のパーセントの同じアミノ酸残基もしくはヌクレオチド すなわち、比較ウィンドウまたは指定された領域にわたって最大限一致するように比較およびアラインメントされた時に、指定された領域にわたって約60%の同一性、好ましくは65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくはそれ以上の同一性 を有する、2つまたはそれ以上の配列または部分配列を指す 例えば、NCBIウェブサイトなどを参照されたい。 次いで、このような配列は「実質的に同一」と言われる。 この定義はまた、試験配列を編集したものも指すか、これに適用されてもよい。 下記のように、好ましいアルゴリズムはギャップなどを明らかにすることができる。 好ましくは、同一性は、長さが少なくとも約25アミノ酸またはヌクレオチドの領域にわって、より好ましくは、長さが50〜100アミノ酸またはヌクレオチドの領域にわって存在する。 配列比較の場合、典型的には、ある配列が参照配列として働き、参照配列と試験配列が比較される。 配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列および参照配列はコンピュータに入力され、必要に応じて、部分配列の座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。 好ましくは、デフォルトプログラムパラメータを使用してもよく、別のパラメータを指定してもよい。 次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて参照配列と比較して試験配列のパーセント配列同一性を計算する。 比較ウィンドウ:本明細書で使用する「比較ウィンドウ」は、20〜600、通常には約50〜約200、より通常には約100〜約150からなる群より選択される連続した位置の数のいずれか1つのセグメントについての言及を含む。 このセグメントにおいて、ある配列と、同じ数の連続した位置の参照配列が最適にアラインメントされた後に、2つの配列を比較することができる。 比較のための配列のアラインメント方法は当技術分野において周知である。 Appl. Math. Mol. Biol. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 1988 の類似性手法のための検索、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行 Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr. , Madison, Wis. の中のGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA 、または手作業によるアラインメントもしくは目視検査によって行うことができる 例えば、Current Protocols in Molecular Biology Ausubel et al. , eds. 1995 補遺 を参照されたい。 パーセント配列同一性および配列類似性を求めるのに適したアルゴリズムの好ましい例は、BLASTおよびBLAST 2. 0アルゴリズムであり、これらは、それぞれ、Altschul et al. , Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 1977 、およびAltschul et al. , J. Mol. Biol. 215:403-410 1990 に記載されている。 本発明の核酸およびタンパク質に対するパーセント配列同一性を求めるために、BLASTおよびBLAST 2. 0が本明細書に記載のパラメータと共に用いられる。 BLAST解析を行うためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Informationのウェブサイトを通じて公的に入手することができる。 このアルゴリズムは、最初に、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントした時に正の値の閾値スコアTにマッチまたは適合する、クエリー配列中の長さWの短いワードを特定することによって、高スコア配列対 high scoring sequence pair HSP を特定することを伴う。 Tは、隣接ワードスコア閾値 neighborhood word score threshold Altschul et. ,前出 と呼ばれる。 これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含むさらに長いHSPを発見する検索を開始するための種配列 seed として働く。 次いで、このワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加する限り、それぞれの配列に沿って両方向に延長される。 アミノ酸配列の場合、累積スコアを計算するためにスコアリング行列が用いられる。 累積アラインメントスコアが、その達成される最大値から量Xだけ減少した時に;1つもしくは複数の負のスコアの残基アラインメントの蓄積のために累積スコアが0もしくはそれ以下になった時に;またはいずれかの配列の末端に到達した時に、各方向でのワードヒットの延長は止まる。 BLASTアルゴリズムパラメータW、T、およびXはアラインメントの感度および速度を決定する。 Natl. Acad. Sci. 発明の詳細な説明生物 本発明は、光独立栄養生物を高光合成生物に変換することを可能にする。 光独立栄養生物には、真核生物の植物および藻類、ならびに原核生物のラン藻類、緑色硫黄細菌、緑色非硫黄細菌、紅色硫黄細菌、および紅色非硫黄細菌が含まれる。 植物には、以下の属:アラビドプシス属 Arabidopsis 、ベータ属 Beta 、グリシン属 Glycine 、ジャトロファ属 Jatropha 、ミスカンサス属 Miscanthus 、パニクム属 Panicum 、パラリス属 Phalaris 、ポプルス属 Populus 、サッカルム属 Saccharum 、サリクス・シモンドシア Salix Simmondsia 、およびゼア属 Zea が含まれるが、これに限定されない。 藻類およびラン藻類には、以下の属:アカントセラス属 Acanthoceras 、アカントコッカス属 Acanthococcus 、アカリオクロリス属 Acaryochloris 、アクナンテス属 Achnanthes 、アクナンチジウム属 Achnanthidium 、アクチナストラウム属 Actinastrum 、アクチノクロリス属 Actinochloris 、アクチノシラス属 Actinocyclus 、アクチノタエニウム属 Actinotaenium 、アンフィクリシス属 Amphichrysis 、アンフィジニウム属 Amphidinium 、アンフィクリコス属 Amphikrikos 、アンフィプレウラ属 Amphipleura 、アンフィプロラ属 Amphiprora 、アンフィスリクス属 Amphithrix 、アンホラ属 Amphora 、アナベナ属 Anabaena 、アナベノプシス属 Anabaenopsis 、アネウマスタス属 Aneumastus 、アンキストロデスマス属 Ankistrodesmus 、アンキラ属 Ankyra 、アノモエオネイス属 Anomoeoneis 、アパトコッカス属 Apatococcus 、アファニゾメノン属 Aphanizomenon 、アファノカプサ属 Aphanocapsa 、アファノカエテ属 Aphanochaete 、スイゼンジノリ属 Aphanothece 、アピオシスティス属 Apiocystis 、アピストネマ属 Apistonema 、アルトロデスマス属 Arthrodesmus 、アルテロスピラ属 Artherospira 、アスコクロリス属 Ascochloris 、ホシガタケイソウ属 Asterionella 、アステロコッカス属 Asterococcus 、アウドウイネラ属 Audouinella 、アウラコセイラ属 Aulacoseira 、イカダケイソウ属 Bacillaria 、バルビアニア属 Balbiania 、バムブシナ属 Bambusina 、ウシケノリ属 Bangia 、バシクラミス属 Basichlamys 、カワモヅク属 Batrachospermum 、ビヌクレアリア属 Binuclearia 、ビトリキア属 Bitrichia 、 ヒメアオノリ属 Blidingia 、ボトルジオプシス属 Botrdiopsis 、フウセンモ属 Botrydium 、ボトリオコッカス属 Botryococcus 、ボトリオスファエレラ属 Botryosphaerella 、ブラキオモナス属 Brachiomonas 、ブラキシラ属 Brachysira 、ブラキトリキア属 Brachytrichia 、ブレビソニア属 Brebissonia 、ブルボカエテ属 Bulbochaete 、ブミレリア属 Bumilleria 、ブミレリオプシス属 Bumilleriopsis 、カロネイス属 Caloneis 、カロトリクス属 Calothrix 、カムピロジスカス属 Campylodiscus 、 カプサアオノリ属 Capsosiphon 、カルテリア属 Carteria 、カテナ属 Catena 、カビヌラ属 Cavinula 、セントリトラクタス属 Centritractus 、セントロネラ属 Centronella 、セラチウム属 Ceratium 、 ツノケイソウ属 Chaetoceros 、カエトクロリス属 Chaetochloris 、ジュズモ属 Chaetomorpha 、カエトネラ属 Chaetonella 、カエトネマ属 Chaetonema 、カエトペルティス属 Chaetopeltis 、カエトフォラ属 Chaetophora 、カエトスファエリジウム属 Chaetosphaeridium 、カマエシフォン属 Chamaesiphon 、シャジクモ属 Chara 、カラシオクロリス属 Characiochloris 、カラシオプシス属 Characiopsis 、カラシウム属 Characium 、カラレス属 Charales 、シロモナス属 Chilomonas 、クライノモナス属 Chlainomonas 、クラミドブレファリス属 Chlamydoblepharis 、クラミドカプサ属 Chlamydocapsa 、クラミドモナス属 Chlamydomonas 、クラミドモノプシス属 Chlamydomonopsis 、クラミドミキサ属 Chlamydomyxa 、クラミドネフリス属 Chlamydonephris 、クロラギエラ属 Chlorangiella 、クロランギオプシス属 Chlorangiopsis 、クロレラ属 Chlorella 、クロロボトリス属 Chlorobotrys 、クロロブラキス属 Chlorobrachis 、クロロキトリウム属 Chlorochytrium 、クロロコックム属 Chlorococcum 、クロログロエア属 Chlorogloea 、クロロゴニウム属 Chlorogonium 、クロロロビオン属 Chlorolobion 、クロロモナス属 Chloromonas 、クロロフィセマ属 Chlorophysema 、クロロフィタ属 Chlorophyta 、クロロサッカス属 Chlorosaccus 、クロロサルキナ属 Chlorosarcina 、コリシスティス属 Choricystis 、クロモフィトン属 Chromophyton 、 ヒカリモ属 Chromulina 、クロオコシジオプシス属 Chroococcidiopsis 、クロオコックス属 Chroococcus 、タマツナギ属 Chroodactylon 、クロオモナス属 Chroomonas 、クロオテセ属 Chroothece 、クリソアメーバ属 Chrysamoeba 、クリサプシス属 Chrysapsis 、クリシジアストラム属 Chrysidiastrum 、クリソカプサ属 Chrysocapsa 、クリソカプセラ属 Chrysocapsella 、クリソカエテ属 Chrysochaete 、クロソクロムリナ属 Chrysochromulina 、クリソコッカス属 Chrysococcus 、クリソクリナス属 Chrysocrinus 、クリソレピドモナス属 Chrysolepidomonas 、クリソリコス属 Chrysolykos 、クリソネブラ属 Chrysonebula 、クリソフィタ属 Chrysophyta 、クリソピキス属 Chrysopyxis 、クリソサッカス属 Chrysosaccus 、クロソファエレラ属 Chrysophaerella 、クリソステファノスファエラ属 Chrysostephanosphaera 、クロドホラ属 Clodophora 、クラスチジウム属 Clastidium 、クロステリオプシス属 Closteriopsis 、ミカヅキモ属 Closterium 、コッコミキサ属 Coccomyxa 、コメツブケイソウ属 Cocconeis 、コエラステラ属 Coelastrella 、コエラストラム属 Coelastrum 、コエロスファエリウム属 Coelosphaerium 、コエノクロリス属 Coenochloris 、コエノコッカス属 Coenococcus 、コエノシスティス属 Coenocystis 、コラシウム属 Colacium 、コレオカエテ属 Coleochaete 、コロディクティオン属 Collodictyon 、コムプソゴノプシス属 Compsogonopsis 、オオイシソウ属 Compsopogon 、コンジュガトフィタ属 Conjugatophyta 、コノカエテ属 Conochaete 、コロナストラム属 Coronastrum 、ツヅミモ属 Cosmarium 、コスミオネイス属 Cosmioneis 、コスモクラジウム属 Cosmocladium 、クラテリポルツラ属 Crateriportula 、クラチクラ属 Craticula 、クリナリウム属 Crinalium 、クルシゲニア属 Crucigenia 、クルシゲニエラ属 Crucigeniella 、クリプトアウラクス属 Cryptoaulax 、クリプトモナス属 Cryptomonas 、クリプトフィタ属 Cryptophyta 、セテノホラ属 Ctenophora 、シアノジクトン属 Cyanodictyon 、シアノネフロン属 Cyanonephron 、シアノフォラ属 Cyanophora 、シアノフィタ属 Cyanophyta 、シアノテセ属 Cyanothece 、シアノトモナス属 Cyanothomonas 、シクロネキシス属 Cyclonexis 、シクロステファノス属 Cyclostephanos 、タイコケイソウ属 Cyclotella 、クリンドロカプサ属 Cylindrocapsa 、クリンドロシスティス属 Cylindrocystis 、クリンドロスペルマム属 Cylindrospermum 、クリンドロテカ属 Cylindrotheca 、ハダナミケイソウ属 Cymatopleura 、クチビルケイソウ属 Cymbella 、シムベロニズシア属 Cymbellonitzschia 、シストジニウム属 Cystodinium 、ダクチロコッコプシス属 Dactylococcopsis 、デバルヤ属 Debarya 、デンチクラ属 Denticula 、デルマトクリシス属 Dermatochrysis 、デルモカルパ属 Dermocarpa 、デルモカルペラ属 Dermocarpella 、デスマトラクタム属 Desmatractum 、チリモ属 Desmidium 、デスモコッカス属 Desmococcus 、デスモネマ属 Desmonema 、デスモシホン属 Desmosiphon 、ジアカントス属 Diacanthos 、ジアクロネマ属 Diacronema 、ジアデスミス属 Diadesmis 、イタケイソウ属 Diatoma 、ジアトメラ属 Diatomella 、ジセルラ属 Dicellula 、ジクトリクス属 Dichothrix 、ジクトモコッカス属 Dichotomococcus 、ジクラノカエテ属 Dicranochaete 、ジクトヨクロリス属 Dictyochloris 、ジクトヨコッカス属 Dictyococcus 、ジクチオスファエリウム属 Dictyosphaerium 、ジジモシスティス属 Didymocystis 、ジジモゲネス属 Didymogenes 、ジジモスフェニア属 Didymosphenia 、ジラビフィラム属 Dilabifilum 、ジモルホコッカス属 Dimorphococcus 、サヤツナギ属 Dinobryon 、ディノコッカス属 Dinococcus 、ジプロクロリス属 Diplochloris 、ジプロネイス属 Diploneis 、ジプロスタウロン属 Diplostauron 、ジストリオネラ属 Distrionella 、ドシジウム属 Docidium 、 ツルギミドロ属 Draparnaldia 、ドゥナリエラ属 Dunaliella 、ジスモルホコッカス属 Dysmorphococcus 、エクバロシスティス属 Ecballocystis 、エラカトスリクス属 Elakatothrix 、エレルベキア属 Ellerbeckia 、エンシオネマ属 Encyonema 、アオノリ属 Enteromorpha 、エントクラジア属 Entocladia 、エントモネイス属 Entomoneis 、エントフィサリス属 Entophysalis 、エピクリシス属 Epichrysis 、エピピキシス属 Epipyxis 、ハフウケイソウ属 Epithemia 、エレモスファエラ属 Eremosphaera 、ユーアストロプシス属 Euastropsis 、ユーアストラム属 Euastrum 、ユーカプシス属 Eucapsis 、ユーココネイス属 Eucocconeis 、ユードリナ属 Eudorina 、ユーグレナ属 Euglena 、ユーグレノフィタ属 Euglenophyta 、イチモンジケイソウ属 Eunotia 、ユースティグマトフィタ属 Eustigmatophyta 、ユートレプティア属 Eutreptia 、ファラシア属 Fallacia 、フィシェレラ属 Fischerella 、オビケイソウ属 Fragilaria 、フラギラリフォルマ属 Fragilariforma 、フランセイア属 Franceia 、ヒシガタケイソウ属 Frustulia 、クルシラ属 Curcilla 、ゲミネラ属 Geminella 、ゲニクラリア属 Genicularia 、グラウコシスティス属 Glaucocystis 、グラウコフィタ属 Glaucophyta 、グレノジニオプシス属 Glenodiniopsis 、グレノジニウム属 Glenodinium 、グロエオカプサ属 Gloeocapsa 、グロエオカエテ属 Gloeochaete 、グロエオクリシス属 Gloeochrysis 、グロエオコッカス属 Gloeococcus 、グロエオシスティス属 Gloeocystis 、グロエオデンドロン属 Gloeodendron 、グレオモナス属 Gloeomonas 、グロエオプラクス属 Gloeoplax 、グロエオテセ属 Gloeothece 、グロエオティラ属 Gloeotila 、グロエオトリキア属 Gloeotrichia 、グロイオジクチオン属 Gloiodictyon 、ゴレンキニア属 Golenkinia 、ゴレンキニオプシス属 Golenkiniopsis 、ゴモンチア属 Gomontia 、ゴムホシムベラ属 Gomphocymbella 、クサビケイソウ属 Gomphonema 、ゴムホスファエリア属 Gomphosphaeria 、ゴナトザイゴン属 Gonatozygon 、ゴングロシア属 Gongrosia 、ゴングロシラ属 Gongrosira 、ゴニオクロリス属 Goniochloris 、ゴニウム属 Gonium 、ゴニオストマム属 Gonyostomum 、グラヌロクロリス属 Granulochloris 、グラヌロシストプシス属 Granulocystopsis 、グロエンブラジア属 Groenbladia 、ギムノジニウム属 Gymnodinium 、ギムノザイガ属 Gymnozyga 、エスガタケイソウ属 Gyrosigma 、ヘマトコッカス属 Haematococcus 、ハフニオモナス属 Hafniomonas 、ハラシア属 Hallassia 、ハンマトイデア属 Hammatoidea 、ハンナエア属 Hannaea 、ユミケイソウ属 Hantzschia 、ハパロシホン属 Hapalosiphon 、ハプロタエニウム属 Haplotaenium 、ハプトフィタ属 Haptophyta 、ハスレア属 Haslea 、ヘミジニウム属 Hemidinium 、ヘミトマ属 Hemitoma 、ヘリバウジエラ属 Heribaudiella 、ヘテロマスティクス属 Heteromastix 、ヘテロスリクス属 Heterothrix 、ヒベルジア属 Hibberdia 、ベニマダラ属 Hildenbrandia 、ヒレア属 Hillea 、ホロペジウム属 Holopedium 、ホモエオスリクス属 Homoeothrix 、ホルマントネマ属 Hormanthonema 、ホルモチラ属 Hormotila 、ヒアロブラキオン属 Hyalobrachion 、ヒアロカルジウム属 Hyalocardium 、ヒアロジスカス属 Hyalodiscus 、ヒアロゴニウム属 Hyalogonium 、ヒアロテカ属 Hyalotheca 、ハイドリアナム属 Hydrianum 、ヒドロコッカス属 Hydrococcus 、ヒドロコレウム属 Hydrocoleum 、オオタマウミヒドラ属 Hydrocoryne 、アミミドロ属 Hydrodictyon 、ヒドロセラ属 Hydrosera 、ミズオ属 Hydrurus 、ヒエラ属 Hyella 、ヒメノモナス属 Hymenomonas 、イストモクロロン属 Isthmochloron 、ヨハネスバプティスチア属 Johannesbaptistia 、ジュラニイエラ属 Juranyiella 、カライエビア属 Karayevia 、カサブレファリス属 Kathablepharis 、カトジニウム属 Katodinium 、ケフィリオン属 Kephyrion 、ケラトコッカス属 Keratococcus 、キルクネリエラ属 Kirchneriella 、クレブソルミジウム属 Klebsormidium 、コルベシア属 Kolbesia 、コリエラ属 Koliella 、コマレキア属 Komarekia 、コルシコビエラ属 Korshikoviella 、クラスケラ属 Kraskella 、ラゲルヘイミア属 Lagerheimia 、ラギニオン属 Lagynion 、シラタマモ属 Lamprothamnium 、レマネア属 Lemanea 、レポシンクリス属 Lepocinclis 、レプトシラ属 Leptosira 、ラボコッカス属 Lobococcus 、ラボシスティス属 Lobocystis 、ロボモナス属 Lobomonas 、ルチコラ属 Luticola 、リングビヤ属 Lyngbya 、マレオクロリス属 Malleochloris 、マロモナス属 Mallomonas 、マントニエラ属 Mantoniella 、マルソニエラ属 Marssoniella 、マルチアナ属 Martyana 、マスチゴコレウス属 Mastigocoleus 、ガストグロイア属 Gastogloia 、メロシラ属 Melosira 、メリスモペディア属 Merismopedia 、メソスティグマ属 Mesostigma 、メソタエニウム属 Mesotaenium 、ミクラクチニウム属 Micractinium 、ミクラステリアス属 Micrasterias 、ミクロカエテ属 Microchaete 、ミクロコレウス属 Microcoleus 、ミクロシスティス属 Microcystis 、ミクログレナ属 Microglena 、ミクロモナス属 Micromonas 、ミクロスポラ属 Microspora 、ミクロタムニオン属 Microthamnion 、ミスココッカス属 Mischococcus 、モノクリシス属 Monochrysis 、モノダス属 Monodus 、モノマスティクス属 Monomastix 、モノラフィジウム属 Monoraphidium 、 ヒトエグサ属 Monostroma 、ヒザオリ属 Mougeotia 、モウゲオチオプシス属 Mougeotiopsis 、ミオクロリス属 Myochloris 、マイロメシア属 Myromecia 、ミクソサルシナ属 Myxosarcina 、ナエゲリエラ属 Naegeliella 、ナンノクロリス属 Nannochloris 、ナウトコッカス属 Nautococcus 、フナガタケイソウ属 Navicula 、ネグレクテラ属 Neglectella 、ネイジウム属 Neidium 、ネフロクラミス属 Nephroclamys 、ネフロシチウム属 Nephrocytium 、ネフロジエラ属 Nephrodiella 、ネフロセルミス属 Nephroselmis 、ネトリウム属 Netrium 、フラスコモ属 Nitella 、ホシツリモ属 Nitellopsis 、ササノハケイソウ属 Nitzschia 、ノドゥラリア属 Nodularia 、ノストック属 Nostoc 、オクロモナス属 Ochromonas 、サヤミドロ属 Oedogonium 、オリゴカエトホラ属 Oligochaetophora 、オニコネマ属 Onychonema 、オオカルジウム属 Oocardium 、オオシスティス属 Oocystis 、オペホラ属 Opephora 、オフィオシチウム属 Ophiocytium 、オルトセイラ属 Orthoseira 、オシラトリア属 Oscillatoria 、オキシネイス属 Oxyneis 、パチクラデラ属 Pachycladella 、パルメラ属 Palmella 、パルモジクチオン属 Palmodictyon 、パンドリナ属 Pnadorina 、パンヌス属 Pannus 、パラリア属 Paralia 、パシェリナ属 Pascherina 、パウルシュルジア属 Paulschulzia 、クンショウモ属 Pediastrum 、ペディネラ属 Pedinella 、ペディノモナス属 Pedinomonas 、ペディノペラ属 Pedinopera 、ペラゴジクチオン属 Pelagodictyon 、ペニウム属 Penium 、ペラネマ属 Peranema 、ペリジニオプシス属 Peridiniopsis 、ペリジニウム属 Peridinium 、ペロニア属 Peronia 、ペトロネイス属 Petroneis 、ファコタス属 Phacotus 、ウチワヒゲムシ属 Phacus 、ファエアスター属 Phaeaster 、フェオデルマチウム属 Phaeodermatium 、フェオフィタ属 Phaeophyta 、フェオスファエラ属 Phaeosphaera 、フェオタムニオン属 Phaeothamnion 、フォルミジウム属 Phormidium 、フィコペルティス属 Phycopeltis 、フィラリオクロリス属 Phyllariochloris 、フィロカルジウム属 Phyllocardium 、フィロミタス属 Phyllomitas 、ハネケイソウ属 Pinnularia 、ピトホラ属 Pitophora 、プラコネイス属 Placoneis 、プランクトネマ属 Planctonema 、プランクトスファエリア属 Planktosphaeria 、プラノチジウム属 Planothidium 、プレクトネマ属 Plectonema 、ヒゲマワリ属 Pleodorina 、プレウラストラム属 Pleurastrum 、プレウロカプサ属 Pleurocapsa 、プレウロクラジア属 Pleurocladia 、プレウロジスカス属 Pleurodiscus 、プレウロシグマ属 Pleurosigma 、プレウロシラ属 Pleurosira 、プレウロタエニウム属 Pleurotaenium 、ポシロモナス属 Pocillomonas 、ポドヘドラ属 Podohedra 、ポリブレファリデス属 Polyblepharides 、ポリカエトホラ属 Polychaetophora 、ポリエドリエラ属 Polyedriella 、ポリエドリオプシス属 Polyedriopsis 、ポリゴニオクロリス属 Polygoniochloris 、ポリエピドモナス属 Polyepidomonas 、ポリタエニア属 Polytaenia 、ポリトマ属 Polytoma 、ポリトメラ属 Polytomella 、ポルフィリディウム属 Porphyridium 、ポステリオクロモナス属 Posteriochromonas 、プラシノクロリス属 Prasinochloris 、プラシノクラダス属 Prasinocladus 、プラシノフィタ属 Prasinophyta 、カワノリ属 Prasiola 、プロクロルフィタ属 Prochlorphyta 、プロクロロトリックス属 Prochlorothrix 、プロトデルマ属 Protoderma 、プロトシフォン属 Protosiphon 、プロバソリエラ属 Provasoliella 、プリムネシウム属 Prymnesium 、プサモジクチオン属 Psammodictyon 、プサモチジウム属 Psammothidium 、シュードアナベナ属 Pseudanabaena 、シュードエノクロニウム属 Pseudenoclonium 、シュードカルテリア属 Psuedocarteria 、シュードカテ属 Pseudochate 、シュードカラシウム属 Pseudocharacium 、シュードコッコミキサ属 Pseudococcomyxa 、シュードジクチオスファエリウム属 Pseudodictyosphaerium 、シュードケフィリオン属 Pseudokephyrion 、シュードンコビルサ属 Pseudoncobyrsa 、シュードクアドリグラ属 Pseudoquadrigula 、シュードスファエロシスティス属 Pseudosphaerocystis 、シュードスタウラストラム属 Pseudostaurastrum 、シュードスタウロシラ属 Pseudostaurosira 、シュードテトラストラム属 Pseudotetrastrum 、プテロモナス属 Pteromonas 、パンクタストルアタ属 Punctastruata 、ピラミクラミス属 Pyramichlamys 、 ピラミモナス属 Pyramimonas 、ピロフィタ属 Pyrrophyta 、クアドリクロリス属 Quadrichloris 、クアドリコッカス属 Quadricoccus 、クアドリグラ属 Quadrigula 、ラジオコッカス属 Radiococcus 、ラジオフィラム属 Radiofilum 、ラフィジオプシス属 Raphidiopsis 、ラフィドセリス属 Raphidocelis 、ラフィドネマ属 Raphidonema 、ラフィドフィタ属 Raphidophyta 、ペイメリア属 Peimeria 、ラブドデルマ属 Rhabdoderma 、ラブドモナス属 Rhabdomonas 、ネダシグサ属 Rhizoclonium 、ロドモナス属 Rhodomonas 、ロドフィタ属 Rhodophyta 、ロイコスフェニア属 Rhoicosphenia 、ロパロジア属 Rhopalodia 、リブラリア属 Rivularia 、ロゼンビンギエラ属 Rosenvingiella 、ロシチジウム属 Rossithidium 、ロヤ属 Roya 、セネデスムス属 Scenedesmus 、シェルフェリア属 Scherffelia 、シゾクラミデラ属 Schizochlamydella 、シゾクラミス属 Schizochlamys 、シゾメリス属 Schizomeris 、シゾトリックス属 Schizothrix 、スクロエデリア属 Schroederia 、スコリオネイス属 Scolioneis 、スコチエラ属 Scotiella 、スコチエロプシス属 Scotiellopsis 、スコウルフィエルジア属 Scourfieldia 、スキトネマ属 Scytonema 、セレナストラム属 Selenastrum 、セレノクロリス属 Selenochloris 、セラホラ属 Sellaphora 、セミオルビス属 Semiorbis 、シデロセリス属 Siderocelis 、ジデロシストプシス属 Diderocystopsis 、ジモンセニア属 Dimonsenia 、シホノネマ属 Siphononema 、シロクラジウム属 Sirocladium 、シロゴニウム属 Sirogonium 、スケレトネマ属 Skeletonema 、ソラストラム属 Sorastrum 、スペルマトゾプシス属 Spermatozopsis 、スファエレロシスティス属 Sphaerellocystis 、スファエレロプシス属 Sphaerellopsis 、スファエロジニウム属 Sphaerodinium 、ヨコワミドロ属 Sphaeroplea 、スファエロゾスマ属 Sphaerozosma 、スピニフェロモナス属 Spiniferomonas 、スパイロジャイラ属 Spirogyra 、スピロタエニア属 Spirotaenia 、スピルリナ属 Spirulina 、スポンジロモラム属 Spondylomorum 、スポンジロシウム属 Spondylosium 、スポロテトラス属 Sporotetras 、スプメラ属 Spumella 、スタウラストラム属 Staurastrum 、スタエロデスマス属 Stauerodesmus 、スタウロネイス属 Stauroneis 、スタウロシラ属 Staurosira 、スタウロシレラ属 Staurosirella 、ステノプテロビア属 Stenopterobia 、ステファノコスティス属 Stephanocostis 、ステファノディスカス属 Stephanodiscus 、ステファノポロス属 Stephanoporos 、ステファノスファエラ属 Stephanosphaera 、スチココッカス属 Stichococcus 、スチコグロエア属 Stichogloea 、スチゲオクロニム属 Stigeoclonium 、スチゴネマ属 Stigonema 、スチピトコッカス属 Stipitococcus 、ストケシエラ属 Stokesiella 、ストロムボモナス属 Strombomonas 、スチロクリサリス属 Stylochrysalis 、スチロジニウム属 Stylodinium 、スチロイキシス属 Styloyxis 、スチロスファエリジウム属 Stylosphaeridium 、スリレラ属 Surirella 、シキジオン属 Sykidion 、シムプロカ属 Symploca 、シネココッカス属 Synechococcus 、シネコシスティス属 Synechocystis 、シネドラ属 Synedra 、シノクロモナス属 Synochromonas 、シヌラ属 Synura 、タベラリア属 Tabellaria 、タブラリア属 Tabularia 、テイリンギア属 Teilingia 、テムノガメタム属 Temnogametum 、テトメモラス属 Tetmemorus 、テトラクロレラ属 Tetrachlorella 、テトラシクラス属 Tetracyclus 、テトラデスマス属 Tetradesmus 、テトラエドリエラ属 Tetraedriella 、テトラエドロン属 Tetraedron 、テトラセルミス属 Tetraselmis 、ヨツメモ属 Tetraspora 、テトラストラム属 Tetrastrum 、タラシオシラ属 Thalassiosira 、タムニオカエテ属 Thamniochaete 、トラコクロリス属 Thorakochloris 、トレア属 Thorea 、トリペラ属 Tolypella 、トリポスリクス属 Tolypothrix 、トラケロモナス属 Trachelomonas 、トラキジスカス属 Trachydiscus 、トレボウキシア属 Trebouxia 、トレンテホリア属 Trentepholia 、トレウバリア属 Treubaria 、トリボネマ属 Tribonema 、アイアカシオ属 Trichodesmium 、トリコジスカス属 Trichodiscus 、トロキスシア属 Trochiscia 、トリブリオネラ属 Tryblionella 、ヒビミドロ属 Ulothrix 、ウログレナ属 Uroglena 、ウロネマ属 Uronema 、ウロソレニア属 Urosolenia 、シリオミドロ属 Urospora 、ウバ属 Uva 、バキュオラリア属 Vacuolaria 、フシナシミドロ属 Vaucheria 、ボルボックス属 Volvox 、ボルブリナ属 Volvulina 、ウェステラ属 Westella 、ウォロスジンスキア属 Woloszynskia 、キサンチジウム属 Xanthidium 、キサントフィタ属 Xanthophyta 、キセノコッカス属 Xenococcus 、ジグネマ属 Zygnema 、ジグネモプシス属 Zygnemopsis 、およびジゴニウム属 Zygonium が含まれるが、これに限定されない。 緑色非硫黄細菌には、以下の属:クロロフレクサス属 Chloroflexus 、クロロネマ属 Chloronema 、オシロクロリス属 Oscillochloris 、ヘリオスリックス属 Heliothrix 、ヘルペトシフォン属 Herpetosiphon 、ロゼイフレキサス属 Roseiflexus 、およびサーモミクロビウム属 Thermomicrobium が含まれるが、これに限定されない。 緑色硫黄細菌には、以下の属:クロロビウム属 Chlorobium 、クラスロクロリス属 Clathrochloris 、およびプロステコクロリス属 Prosthecochloris が含まれるが、これに限定されない。 紅色硫黄細菌には、以下の属:アロクロマチウム属 Allochromatium 、クロマチウム属 Chromatium 、ハロクロマチウム属 Halochromatium 、イソクロマチウム属 Isochromatium 、マリクロマチウム属 Marichromatium 、ロドブラム属 Rhodovulum 、サーモクロマチウム属 Thermochromatium 、チオカプサ属 Thiocapsa 、チオロドコッカス属 Thiorhodococcus 、およびチオキスチス属 Thiocystis が含まれるが、これに限定されない。 紅色非硫黄細菌には、以下の属:ファエオスピリラム属 Phaeospirillum 、ロドバカ属 Rhodobaca 、ロドバクター属 Rhodobacter 、ロドミクロビウム属 Rhodomicrobium 、ロドピラ属 Rhodopila 、ロドシュードモナス属 Rhodopseudomonas 、ロドサラシウム属 Rhodothalassium 、ロドスピリラム属 Rhodospirillum 、ロドビブリオ属 Rodovibrio 、およびロゼオスピラ属 Roseospira が含まれるが、これに限定されない。 高光合成変換には、大規模な遺伝子改変 表1および表2 が必要である。 従って、好ましい態様において、親の光独立栄養生物を外因性DNAで形質転換することができる。 高光合成変換に好ましい生物には、シロイヌナズナ Arabidopsis thaliana 、パニクム・ビルガタム Panicum virgatum 、ミスカンサス・ギガンテウス Miscanthus giganteus 、およびトウモロコシ Zea mays 植物 、ボトリコッカス・ブラウニ Botryococcus braunii 、コナミドリムシ Chlamydomonas reinhardtii 、およびデュナリエラ・サリナ Dunaliela salina 藻類 、シネココッカス属の種PCC7002、シネココッカス属の種PCC7942、シネコシスティス属の種PCC6803、およびサーモシネココッカス・エロンガタスBP-1 ラン藻類 、クロロビウム・テピダム Chlorobium tepidum 緑色硫黄細菌 、クロロフレクサス・アウランチカス Chloroflexus auranticus 緑色非硫黄細菌 、クロマチウム・テピダム Chromatium tepidum 、およびクロマチウム・ビノサム Chromatium vinosum 紅色硫黄細菌 、ロドスピリラム・ラブラム Rhodospirillum rubrum 、ロドバクター・カプスラタス Rhodobacter capsulatus 、およびロドシュードモナス・パラスリス Rhodopseudomonas palusris 紅色非硫黄細菌 が含まれる。 繁殖 液体培地中で、またはアガロース含有プレート上で光合成生物を培養する方法は、当業者に周知である 例えば、ATCCおよびInstitute Pasteurに関連したウェブサイトを参照されたい。 65mM NaNO3、0. 18mM K2HPO4、0. 3mM MgSO4、0. 25mM CaCl2、0. 03mM クエン酸、0. 03mM クエン酸鉄アンモニウム、0. 003mM EDTA、0. 19mM Na2CO3、2. 4 において培養される 例えば、Institute Pasteurに関連したウェブサイト、およびPrice GD, Woodger FJ, Badger MR, Howitt SM, Tucker L. 「Identification of a SulP-type bicarbonate transporter in marine cyanobacteria. Proc Natl. Acad. Sci USA 2004. 101 52 :18228-33を参照されたい。 サーモシネココッカス・エロンガタスBP-1 かずさDNA研究所、日本から入手可能 は、[Iwai M, Katoh H, Katayama M, Ikeuchi M. 「Improved genetic transformation of the thermophilic cyanobacterium, Thermosynechococcus elongatus BP-1. 」 Plant Cell Physiol 2004. 45 2 :171-175 ]に記載のように、20mM TES-KOH pH8. 2 を添加したBG11培地において繁殖される。 コナミドリムシ Duke University, Durham, North Carolinaが管理しているChlamydomonas Center culture collectionから入手可能 は、 Geraghty AM, Anderson JC, Spalding MH. 「A 36 kilodalton limiting-CO2 induced polypeptide of Chlamydomonas is distinct from the 37 kilodalton periplasmic anhydrase. 」 Plant Physiol 1990. 0M MOPSからなる最小塩培地において増殖される。 前記は、典型的な繁殖条件を規定している。 光は、自然照明 太陽光 、標準的な白熱灯、蛍光灯、もしくはハロゲン電球を含む様々な機構によって、または特別に設計された照明付グロースチャンバー 例えば、モデルLI15照明付グロースチャンバー Sheldon Manufacturing, Inc. Cornelius, OR 内での繁殖によって当てられる。 二酸化炭素は、固体培地添加物 すなわち、重炭酸ナトリウム の含有によって、または気体としてグロースインキュベーターまたは培地に分散させることによって供給される。 ほとんどの実験は、1〜30%の濃度の高濃度の二酸化炭素ガスを用いて行われる。 二酸化炭素ガスは、生物が混合するのに十分な速度で、直接、増殖培地に入れて通気される。 高濃度の二酸化炭素ガスが用いられる場合、ガスは市販のボンベから純粋な形で、または優先的に、石炭プラント、精製所、セメント製造施設、天然ガス施設、醸造所などからの排ガスもしくは煙道ガスを含む高濃度の供給源から生じる。 プラスミド 遺伝子工学に関連するプラスミドは、典型的には、少なくとも2つの機能エレメント1 宿主生物内でのDNA配列の増幅を可能にする複製起点、および2 選択マーカー 例えば、アンピシリン、カナマイシン、ゼオシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、スペクチノマイシンなどに対する耐性を付与する抗生物質耐性マーカー を含む。 プラスミドは、主な目的が望ましい異種DNAインサートの増幅である場合、「クローニングベクター」と呼ばれることが多い。 プラスミドはまた、異種DNAインサートの転写および翻訳を誘導するシス作用調節配列 例えば、プロモーター、転写ターミネーター、リボソーム結合部位 を含んでもよい。 このようなプラスミドは「発現ベクター」と呼ばれることが多い。 プラスミドが、複数種での増幅を可能にする機能エレメントを含有する場合、このようなプラスミドは「シャトルベクター」と呼ばれる。 シャトルベクターは当業者に周知である。 例えば、pSE4は、大腸菌およびシネココッカス属での増幅を可能にするシャトルベクターである[Maeda S, Kawaguchi Y, Ohy T, and Omata T. Bacteriol. 1998. 180:4080-4088]。 関心対象の光独立栄養生物への形質転換による導入の前に、大腸菌において遺伝子および調節配列の容易な操作を可能にするシャトルベクターは、本発明において特に有用である。 形質転換法 原核生物の標準的な形質転換法は当業者に周知である[Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc. , San Diego, Calif. ; Sambrook et al. 1989 Molecular Cloning--A Laboratory Manual 2nd ed. Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, N. ;およびCurrent Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al. , eds. , Current Protocols, Greene Publishing Associates, Inc. の合弁事業, 1997 補遺まで、およびこれを含む ]。 多くの原核生物は天然でコンピテントである。 他の原核生物は、化学処理によってコンピテントにすることができる。 形質転換法の非限定的な例には、外因性DNAの存在下での直接インキュベーション、熱ショックによる形質転換、エレクトロポレーションによる形質転換、バイオリスティックパーティクルボンバードメントによる形質転換、脂質もしくは融合剤 すなわち、ポリエチレングリコール の添加による形質転換、異種微生物との接合、またはウイルス粒子を介した形質導入が含まれる。 シネココッカス属の種PCC7002細胞は、[Essich ES, Stevens Jr E, Porter RD 「Chromosomal Transformation in the Cyanobacterium Agmenellum quadruplicatum. 」 J Bacteriol 1990. 172 4 :1916-1922]に以前に記載された最適化プロトコールに従って形質転換される。 「The production of hydrogen peroxide by green algae: a survey. 」 J. Phycology 1973. 9体積の細胞を、0. 6%培地A重層寒天2. 5mLにプレートし、インキュベートする。 滅菌したパスツールピペットを用いて、適切な濃度の抗生物質を含有する0. 6%培地A寒天2. 0mLを下層におくことによって、細胞に抗生物質を曝露した。 3〜4日後に、形質転換体を選択した。 サーモシネココッカス・エロンガタスBP-1細胞は、[Iwai M, Katoh H, Katayama M, and Ikeuchi M. 「Improved genetic transformation of the thermophilic cyanobacterium Thermosynechococcus elongatus BP-1. Plant Cell Physiol 2004. 45 2 :171-175]に以前に記載された最適化プロトコールに従って形質転換される。 細胞を、適切な抗生物質を含有するBG11プレートに直接プレートするか、任意で、0. 形質転換は、典型的には、レシピエント細胞と、大腸菌から単離された精製プラスミドDNAとのインキュベーションを伴う。 対照的に、細菌接合は、ある細菌種から別の細菌種にDNAを直接導入する別の手段を提供する。 例えば、大腸菌と、シネコシスティス属 Synechocystic PCC6803およびPCC6714、ならびにシネココッカス属PCC7942およびPCC6301、ならびに好熱性シネココッカス・エロンガタス Synechococcus elongatus を含むラン藻との接合を可能にする技法は、に記載されている。 真核生物光独立栄養体の形質転換に関連する技法は当業者に公知である。 Enzymol. , Vol. ;およびClark M S, 1997, Plant Molecular Biology, Springer, N. 、ならびに「真核生物藻類を形質転換するための方法およびツール Methods and tools for transformation of eukaryotic algae 」米国特許第6,027,900号を参照されたい。 コナミドリムシ細胞の形質転換のために様々なアプローチを使用することができる。 コナミドリムシ核区画の形質転換は、[Kindle KL. 「High-frequency nuclear transformation of Chlamydomonas reinhardtii. 」 Proc Natl Acad Sci 1990. 87:1228-1232]に記載のように行われる。 簡単に言えば、細胞を1. その後に、再懸濁した細胞を線状プラスミドDNAまたは環状プラスミドDNAとインキュベートし、300mgの0. 5mmガラスビーズの存在下で、Genie Vortex IIミキサー Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA を用いて最大速度で10〜30秒間、攪拌する。 すぐに、細胞を、適切な抗生物質または栄養分選択を含有するアガロースプレートにプレートする。 または、コナミドリムシ細胞をアガロースプレートに直接プレートし、これに、[Sodeinde OA and Kindle KL. 「Homologous recombination in the nuclear genome of Chlamydomonas reinhardtii. 」 Proc Natl Acad Sci 1993. コナミドリムシ葉緑体は、 Kindle KL, Richards KL, Stern DB. 「Engineering the chloroplast genome: Techniques and capabilities for chloroplast transformation in Chlamydomonas reinhardtii. Proc Natl Acad Sci. 2001. 88:1721-1725 に記載のように形質転換される。 簡単に言えば、細胞を、対数期中期まで、任意で、0. 5mM 5-フルオロデオキシウリジンの存在下で増殖させ、300mgの0. 5mmガラスビーズの存在下で、一本鎖プラスミドDNAまたは二本鎖プラスミドDNAと共に、Genie Vortex IIミキサーを用いて最大速度で15〜30秒間、攪拌する。 攪拌後すぐに、細胞を、適切な濃度の抗生物質を含有する選択用寒天プレートにプレートする。 コナミドリムシミトコンドリアは、 Remacle C, Cardol P, Coosemans N, Galsne M, and Bonnefoy N. 「High-efficiency biolistic transformation of Chlamydomonas mitochondria can be used to insert mutations in complex I genes. 」 Proc Natl Acad Sci 2006. 103: 4771-4776. ]に記載のように形質転換される。 プレートは、マイクロキャリアアセンブリから約7cmの位置に配置され、任意で、形質転換効率を高めるためにストッピングスクリーンを使用する。 表1および表2は、既存の光独立栄養生物に高光合成特性を伝える好ましい遺伝子を規定する。 表1は、炭素固定速度、耐熱性、pH耐性、煙道ガス耐性、耐塩性、集光性効率、還元力発生、および栄養分非依存性を増強するために過剰発現される遺伝子と、関連する経路、酵素委員会 EC 番号、例示的な遺伝子名、供給源生物、GenBankアクセッション番号、および代替の供給源に由来するホモログに関する情報を列挙する。 親の生物が、示された酵素活性を有する遺伝子をコードする場合でも、CO2固定を改善するために、これらの成分を過剰発現することが有用である。 1つの態様において、天然酵素配列が過剰発現される。 好ましい態様において、外因性遺伝子を過剰発現することが有用であり、これにより、バイオプロセスにおけるより明確な調節制御、および天然遺伝子に明確に焦点を合わせた、中心的な代謝調節の影響を潜在的に緩和する手段が可能になる。 DNA2. 0 Menlo Park, CA 、Blue Heron Biotechnology Bothell, WA 、およびGeneart Regensburg, Germany を含む別の供給業者もまた、述べられたように用いられる。 最初に、インサートを、クローニングベクター、例えば、pUC19に入れて増幅および配列決定する。 重要なことに、pUC19に入れた関心対象の各遺伝子の一次合成および配列検証によって、様々に組み合わせた各単位を、望ましい酵素の転写および翻訳を推進する別のデスティネーションベクターに移すよう融通がきくようになる。 必要とされる代謝経路は、最初に、常に「オン」の構成的プロモーターによって推進される発現カセット内にコードされる。 Activities of Constitutive Promoters in Escherichia coli. Mol Biol 1999. Vol 292, Number 1, pgs 19-37]、米国特許5,846,744号に記載のクロレラ Chlorella ウイルスプロモーター[「クロレラウイルスプロモーター」]、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター[Zheng X, Deng W, Luo K, Duan H, Chen Y, McAvoy R, Song S, Pei Y, Li Y. 「The cauliflower mosaic virus CaMV 35S promoter sequence alters the level and patterns of activity of adjacent tissue- and organ-specific gene promoters. 」 Plant Cell Rep 2007. 26 8 :1195-1203]、アナベナ属の構成的petHプロモーター[Valladares A, Muro-Pastor AM, Fillat MF, Herrero A, Flores E. 」 FEBS Lett 1999. 449 2-3 :159-64]、クラミドモナス属のRbcS2プロモーター[Leon R, Couso I, Fernandez E. 「Metabolic engineering of ketocarotenoids biosynthesis in the unicellular microalgae Chlamydomonas reinhardtii. 」 J Biotechnol 2007. 130 2 :143-152]、およびミクロキスティス・アルギノーザ Microcystis aeruginosa K-81のpsbAコアプロモーター配列[Shibato J, Asayama M, Shirai M. 「Specific recognition of the cyanobacterial psbA promoter by RNA polymerases containing principal sigma factors. 」 Biochim. Biophys Acta 1998. 1442 2-3 :296-303]は公知である。 必要に応じて、経路を設計および試験した後、転写レベルを増加または減少させてネットワークを最適化するために、例えば、保存された-35エレメントおよび-10エレメント、またはこれらのエレメント間の間隔を改変することによって、構成的プロモーターの強度が「調整」される。 構成的発現が最適でない すなわち、有害な作用を有する、ネットワークとかみ合わないなど と分かったら、誘導性プロモーターが用いられる。 誘導性プロモーターは、誘導剤、しばしば、低分子または代謝産物を添加する前は「オフ」である 転写されない。 適切な誘導性プロモーター系の例には、アラビノース誘導性Pbad [Khlebnikov A, Datsenko KA, Skaug T, Wanner BL, Keasling JD. 「Homogeneous expression of the P BAD promoter in Escherichia coli by constitutive expression of the low-affinity high-capacity AraE transporter. 」 Microbiology 2001. 147 Pt 12 : 3241-7]、ラムノース誘導性 rhaPBADプロモーター [Haldimann A, Daniels L, Wanner B. J Bacteriol 1998. 「Use of new methods for construction of tightly regulated arabinose and rhamnose promoter fusions in studies of the Escherichia coli phosphate regulon. 」 180:1277-1286]、プロピオン酸誘導性pPRO[Lee SK and Keasling JD. 「A propionate-inducible expression system for enteric bacteria. 」 Appl Environ Microbiol 2005. 71 11 :6856-62 ]、IPTG誘導性lacプロモーター[Gronenborn. Mol Gen Genet 1976. 「Overproduction of phage lambda repressor under control of the lac promoter of Escherichia coli. 」 148:243-250]、合成tacプロモーター[De Boer HA, Comstock LJ, Vasser M. 「The tac promoter: a functional hybrid derived from the trp and lac promoters. 」 PNAS 1983. 80:21-25]、合成trc プロモーター[Brosius J, Erfle M, Storella J. 「Spacing of the -10 and -35 regions in the tac promoter. Effect on its in vivo activity. 」 J Biol Chem 1985. 260:3539-3541]、またはT7 RNA ポリメラーゼ 系[Studier FW and Moffatt BA. 「Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. 」 J Mol Biol 1986]. 「Use of the tetracycline promoter for the tightly regulated production of a murine antibody fragment in Escherichia coli」 Gene 1994. 151:131-135]、コナミドリムシのニッケル誘導性Cpx1およびCyc6 プロモーター[Quinn JM, Kropat J, Merchant S. 「Copper response element and Crr1-dependent nickel-responsive promoter for induced, reversible gene expression in Chlamydomonas reinhardtii. 」 Eukaryotic Cell 2003. 2 5 :995-1002]、シネココッカス属の亜硝酸誘導性nirAプロモーター[Qi Q, Hao M, Ng W, Slater SC, Baszis SR, Weiss JD, and Valentin HE. 「Application of the Synechococcus nirA promoter to establish an inducible expression system for engineering the Synechocystis tocopherol pathway. 」 Appl. Environ. Microb 2005 71 10 :5678-5684]、ボルボックス属の硫黄応答性アリールスルファターゼプロモーター[Hallman A and Sumper M. 「Reporter genes and highly regulated promoters as tools for transformation experiments in Volvox carteri. 」 Proc Natl Acad Sci 1994. 91 24 :11562-11566]が含まれる。 これらの、および他の天然誘導性プロモーターまたは合成により得られた誘導性プロモーターが用いられる 例えば、米国特許第7,235,385号;組換えタンパク質の発現を増強する方法 Methods for enhancing expression of recombinant proteins を参照されたい。 さらなる層の発現制御を提供するために、別の複製起点が選択される。 細胞1個あたりのコピー数は「遺伝子投与量効果」の一因となる。 例えば、高レベルの遺伝子発現の一因となる細胞1個あたり300〜1000コピーの各プラスミドを作製するために、高コピーpMB1またはcolE1起点が用いられる。 対照的に、コピー数を細胞1個あたり約1〜20コピーに制限するために、低コピー起点をコードするプラスミド、例えば、pSC101またはp15Aが活用される。 プラスミドコピー数をさらに調整する技法および配列は公知である 例えば、米国特許第5,565,333号、プラスミド複製起点を含有するプラスミドのコピー数を増やすプラスミド複製起点 Plasmid replication origin increasing the copy number of plasmid containing said origin ;米国特許第6,806,066号、プラスミドコピー数を制御するための改変ColE1複製起点を有する発現ベクター Expression vectors with modified ColE1 origin of replication for control of plasmid copy number を参照されたい。 シネココッカス属の種PCC7002を含む、ある特定の生物は、様々なコピー数を有する内因性プラスミドをコードする[Yano S, Kawata Y, Kojima H. 「Salinity-dependent copy number changes of endogenous plasmids in Synechococcus sp. PCC 7002]。 従って、発現カセットを別個の内因性プラスミドに標的化することによって、遺伝子投与量を改変することができる。 発現レベルはまた、翻訳効率を調整することによっても最適化される。 大腸菌では、シャイン・ダルガノ SD 配列[Shine J and Dalgarno L. Nature 1975 「Determination of cistron specificity in bacterial ribosomes. 」254 5495 :34-8]は、リボソームをmRNAに向け、リボソームと開始コドンを並べることによって翻訳開始を容易にするコンセンサス配列である。 適宜、翻訳効率を上げるまたは下げるために、SD配列の調整が用いられる。 注目すべきことに、ある特定の状況では、SD配列の非存在下で高レベルの翻訳が観察されることがある[Mutsuda M and Sugiura M. 「Translation initiation of cyanobacterial rbcS mRNAs requires the 38-kDa ribosomal protein S1 but not the Shine-Dalgarno sequence. 」 J Biol Chem 2006. 281 50 :38314-38321; Xu J, Mironova R, Ivanov IG, Abouhaidar MG. J Basic Microbiol 1999. 「A polylinker-derived sequence, PL, highly increased translation efficiency in Escherichia coli. 」39 1 :51-60]。 発現レベルを調整するために、関心対象の遺伝子内で、または関心対象の遺伝子外で、mRNA二次構造が操作される。 翻訳レベルを上げるまたは下げるために、コドン使用頻度も操作される。 ある態様では、関心対象の各遺伝子は特有のプラスミドにおいて発現される。 好ましい態様において、望ましい生合成経路は多シストロンプラスミドベクターにおいて発現される。 有用な発現ベクターが内部で設計され、外部の遺伝子合成供給業者によって合成されている。 最適化 最初に、前記のエピソームプラスミドを用いて、以下の生合成経路およびモジュールが試験および最適化される。 非限定的な最適化には、プロモーターの交換および調整、リボソーム結合部位の操作、遺伝子の順番の変更 例えば、遺伝子ABC対BAC、CBA、CAB、BCA 、分子シャペロンの同時発現、活性を上げるもしくは下げるような遺伝子配列のランダム変異誘発もしくは標的化変異誘発、フォールディング、またはアロステリック調節、別の種に由来する遺伝子配列の発現、コドン操作、細胞内標的化配列、例えば、シグナル配列の付加もしくは除去などが含まれる。 それぞれの遺伝子またはモジュールが個々にまたは交互に、並行して最適化される。 その後に、機能的なプロモーターおよび遺伝子配列は、当業者に公知の標準的な技法を用いて、選択圧 すなわち、抗生物質の含有 の非存在下で安定して増幅できるように光独立栄養宿主の染色体に組み込まれる。 表2は、炭素固定速度、耐熱性、pH耐性、煙道ガス耐性、耐塩性、集光性効率、還元力発生、および栄養分非依存性を高めるために下方制御またはノックアウトされる遺伝子と、関連する経路、酵素委員会 EC 番号、例示的な遺伝子名、供給源生物、およびGenBankアクセッション番号に関する情報を列挙している。 内因性DNA配列の破壊 ある特定の場合では、宿主生物に天然にある すなわち、「内因性」の 染色体DNA配列が変えられる。 特定の遺伝子産物の発現を増加および減少させるために、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーターなどを含む非コード領域が操作される。 別の態様では、目的のタンパク質の安定性、フォールディング、活性、または局在化に影響を及ぼすように、内因性遺伝子のコード配列が変えられる。 または、特定の遺伝子を、完全に欠失または「ノックアウト」することができる。 このような操作のための技法および方法は当業者に公知である。 ある特定の態様において、内因性遺伝子の発現レベルを下げるために、転写後遺伝子サイレンシング PTGS が、異種RNA配列、しばしば、破壊を必要とする遺伝子に対するアンチセンスの発現を介して用いられる。 他の態様において、内因性遺伝子発現を下方制御するために、天然にコードされるまたは外因性の低分子RNAまたはミクロRNA種の発現が用いられる。 選択およびアッセイ 選択圧は、高光合成生物を試験および最適化するための評価可能な手段を提供する。 高温度下でも生き残る能力は、改善した耐熱性モジュールが首尾よく働いているという証拠となる。 煙道ガス または煙道ガス組成物に近い人工気体製剤 を通気した培地中で増殖する能力によって、改善した煙道ガス耐性モジュールが首尾よく働いていることが確かめられる。 野生型対応物より速く複製する能力によって、改善したCO2固定モジュールが首尾よく働いていることが確かめられる。 培地添加物としてビタミンB12を欠く培地中で生き残り、複製する能力によって、ビタミンB12モジュールが首尾よく働いていることが確かめられる。 所望であれば、選択圧の前に、変異原、例えば、紫外光、アルキル化剤[例えば、エチルメタンスルホン酸 EMS 、メチルメタンスルホン酸 MMS 、硫酸ジエチル DES 、およびニトロソグアニジン NTG、NG、MMG ]、DNAインターカレーター 例えば、臭化エチジウム 、亜硝酸、塩基類似体、ブロモウラシル、トランスポゾンなどを用いた処理によって、さらなる遺伝的変異を導入することができる。 発酵方法 高光合成生物からの産物の産生および単離は、特定の発酵法を使用することによって強化することができる。 産生を最大にしながら、費用を少なくする必須の要素は、このような産物に変換される炭素源のパーセントを高めることである。 炭素原子は、正常な細胞生活環の間に、脂質、糖類、タンパク質、および核酸の産生を含む細胞機能に進む。 産物に関連しない活性に必要な炭素の量を減らすことによって、産生物の産生の効率を高めることができる。 これは、最初に、微生物を望ましい密度まで増殖させることによって実現する。 好ましい密度は、対数増殖期のピークに達した密度であろう。 このような時点で、細胞増殖を止めるように複製チェックポイント遺伝子を利用することができる。 具体的には、クオラムセンシング機構 Camilli, A. and Bassler, B. L Science 311:1113; Venturi, V. FEMS Microbio Rev 30: 274;およびReading, N. and Sperandio, V. FEMS Microbiol Lett 254:1において概説される を使用して、遺伝子、例えば、p53、p21、または他のチェックポイント遺伝子を活性化することができる。 大腸菌の細胞複製および細胞増殖を止めるために活性化することができる遺伝子には、umuDC遺伝子が含まれる。 この遺伝子が過剰発現されると、対数期から進行が止まり定常増殖になる Murli, S. , Opperman, T. , Smith, B. , and Walker, G. 2000 Journal of Bacteriology 182: 1127. UmuCは、ほとんどのUV変異誘発および化学変異誘発の機構基礎である非コード損傷にわたって損傷乗り越え合成を行うことができるDNAポリメラーゼである。 umuDC遺伝子産物は、損傷乗り越え合成プロセスに必要であり、DNA損傷チェックポイントとしても役立つ。 同時に、これらの産物合成遺伝子が活性化され、従って、産物が作られると同時に、使用される重要な複製経路および維持経路の必要が最小限になる。 または、細胞増殖および産物産生は同時に達成することができる。 この方法では、細胞はバイオリアクター内で増殖され、投入物は連続して供給され、産物は連続して取り出される。 バッチ、フェドバッチ、および 連続発酵が一般的であり、当技術分野において周知であり、例は、Thomas D. Brock in Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition 1989 Sinauer Associates, Inc. , Sunderland, Mass. 、またはDeshpande, Mukund V. , Appl. Biochem. Biotechnol 1992 , 36:227において見出される。 全ての産生方法において、投入物には、二酸化炭素、水、および光が含まれる。 二酸化炭素は大気に由来してもよく、石炭プラント、精製所、セメント製造施設、天然ガス施設、醸造所などからの排ガスまたは煙道ガスを含む高濃度の供給源に由来してもよい。 水は、無塩でもよく、低塩分でもよく、海の水でもよく、高塩分でもよい。 光は、太陽光でもよく、白熱灯、LED、光ファイバー、および蛍光灯を含む人工光源でもよい。 集光性生物は、その生産性が、太陽の照射が集光性生物の光化学系を活性化するのに十分な時に限定されない。 好ましい集光性生物バイオプロセスでは、細胞は、エネルギー駆動装置として光を用いて増殖および産物の産生を可能にする。 十分な光が無ければ、細胞は、中心的な代謝速度を最小限にするように誘導することができる。 この目的で、選択された産物の中にエネルギーを貯蔵して細胞を動かすように、産物の産生に特異的な誘導性プロモーターを強く刺激することができる。 十分な誘導力があれば、細胞は増殖の労力を最小限にし、集光からの蓄えを、特異的に産物の産生のために使用する。 それにもかかわらず、光子が全く捕獲されないか、ほとんど捕獲されない十分な光を欠く時に、正味の生産性は最小になると予想される。 好ましい態様において、細胞は、最終産物が細胞から放出されるように操作される。 最終産物が細胞から放出される態様では、連続法を使用することができる。 このアプローチでは、所望の産物を産生する生物を含むリアクターを、複数の手法で組み立てることができる。 1つの態様において、リアクターは連続してまとめて操作され、培地の一部は取り出され、水性産物が自己分離し、取り出された産物および残りが発酵チャンバーに戻されるように、あまり攪拌されない環境内で保持される。 産物が分離して水相に入らない態様では、培地が取り出され、適切な分離法 例えば、クロマトグラフィー、蒸留など が用いられる。 別の態様において、産物は細胞から分泌されない。 この態様において、フェドバッチ発酵アプローチが用いられる。 このような場合、反応チャンバーが細胞および産物で飽和するまで、細胞は、前記のように投入物 光、水、および二酸化炭素 に連続して曝露された状態で増殖される。 培養物の大部分〜全てが取り出され、細胞が溶解され、適切な分離法 例えば、クロマトグラフィー、蒸留、濾過、遠心分離など によって、産物が単離される。 好ましい態様において、発酵チャンバーは、連続した還元的発酵を受けている発酵物を密閉している。 この場合、安定した還元環境が作り出される。 電子の平衡は、二酸化炭素 気体の形をしている を放出することによって維持される。 遺伝子および細胞産物の検出および分析 本発明の改変生物によって産生された産物のレベルおよび同一性を分析するために、ガスクロマトグラフィー-質量分析、および液体クロマトグラフィー-質量分析、HPLC、キャピラリー電気泳動、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析などの任意の標準的な分析方法を使用することができる。 高光合成細胞において新たな機能的生化学経路が形成したことを検出できることは、本方法の実施にとって重要である。 一般的に、前記のアッセイは、例えば、新規合成経路の一部として、または宿主細胞環境において異所的に供給される分子の化学修飾によって有機低分子などを産生する、宿主細胞の異種の生化学的変換反応を検出するために行われる。 宿主細胞による、このような分子の生成は「試験抽出物」中で検出されてもよい。 「試験抽出物」は、条件培地、細胞溶解産物、細胞膜、またはその半精製もしくは精製された分画産物でもよい。 細胞断片ではなく細胞全体に及ぼす宿主細胞によって生じた活性の影響を試験するために、レスポンダー細胞を用いてアッセイがセットアップされた場合、宿主細胞および試験細胞は共培養されてもよい 任意で、カルチャーインサート、例えば、Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA, カタログ番号40446によって分離されてもよい。 ある特定の態様において、アッセイは、化学的技法または測光法によって、組換え宿主細胞の生合成経路によって産生 または破壊 された分子種を直接検出するようにセットアップされる。 このような分子種の産生または分解は、少なくとも一部は、異種ゲノムDNAの発現に依存しなければならない。 他の態様において、アッセイは、宿主細胞における表現型変化を観察することによって、例えば、宿主細胞内の異種生合成経路の確立に依存したオートクライン様式で、異種経路の産物の形成を間接的に検出する。 例えば、試験抽出物のクロマトグラフィー分離または他の生化学的分離が行われてもよく、類似体の有無は、公知の化合物が類似条件下で生じる画分中で、例えば、分光測定により検出される。 関連する態様において、試験試料と異種細胞 「試験細胞」 またはその成分を接触させることによって、全てのもしくは分画した培地または組換え宿主細胞からの溶解産物をアッセイすることができる。 例えば、試験細胞は原核細胞または真核細胞でもよく、組換え宿主細胞からの条件培地 全てまたは分画 と接触され、条件培地が、試験細胞から生物学的応答または生化学的応答を誘導する能力が評価される。 例えば、アッセイは、試験細胞における表現型変化を、例えば、遺伝子の転写速度もしくは翻訳速度またはスプライシングパターン;タンパク質の安定性;タンパク質、核酸、または脂質のリン酸化、プレニル化、メチル化、グリコシル化、または他の翻訳後修飾;セカンドメッセンジャー、例えば、cAMP、イノシトールリン酸の生成などの変化として検出することができる。 このような作用は、例えば、細胞の特定成分を単離および研究することによって直接測定されてもよく、例えば、レポーター遺伝子発現、表現型マーカーの検出、および試験細胞に対する細胞傷害性活性または細胞分裂停止活性によって、間接的に測定されてもよい。 組換え宿主細胞によって産生された試験化合物の生理活性をスクリーニングする場合、細胞内セカンドメッセンジャーの生成を直接測定することができる。 様々な細胞内エフェクターが同定されている。 例えば、受容体またはイオンチャネルにより調節される事象の阻害剤または増強剤として、化合物または化合物をコードする遺伝子を単離することを目的としたスクリーニングの場合、下流シグナル伝達タンパク質、例えば、アデニリルシクラーゼ、ホスホジエステラーゼ、ホスホイノシチダーゼ、ホスホイノシトールキナーゼ、およびホスホリパーゼからの、セカンドメッセンジャーの生成レベルを検出することができ、様々なイオンの細胞内レベルも同様に検出することができる。 多くのレポーター遺伝子および転写調節エレメントが当業者に公知であり、他のレポーター遺伝子および転写調節エレメントは、当業者に公知の方法によって同定または合成することができる。 1987 , Mol. Cell. Biol. 7:725-737 ;細菌ルシフェラーゼ Engebrecht and Silverman 1984 , PNAS 1: 4154-4158; Baldwin et al. 1984 , Biochemistry 23: 3663-3667 ;アルカリホスファターゼ Toh et al. 1989 Eur. Biochem. 182: 231-238, Hall et al. 1983 J. Mol. Appl. Gen. 2: 101 、ヒト胎盤分泌アルカリホスファターゼ Cullen and Malim 1992 Methods in Enzymol. レポーター遺伝子構築物において使用するための、または指標遺伝子のゲノム遺伝子座を改変するための転写制御エレメントには、プロモーター、エンハンサー、ならびにリプレッサーおよびアクチベーター結合部位が含まれるが、これに限定されない。 適切な転写調節エレメントは、発現が迅速に誘導される、概して、発現が、細胞表面タンパク質と、細胞表面タンパク質の活性を調整するエフェクタータンパク質が接触して数分以内に誘導される、遺伝子の転写調節領域に由来してもよい。 このような遺伝子の例は、最初期遺伝子 Sheng et al. 1990 Neuron 4: 477-485を参照されたい 、例えば、c-fosが含まれるが、これに限定されない。 最初期遺伝子は、リガンドと細胞表面タンパク質が結合すると迅速に誘導される遺伝子である。 遺伝子構築物における使用に好ましい転写制御エレメントには、最初期遺伝子に由来する転写制御エレメント、最初期遺伝子の特徴の一部もしくは全てを示す他の遺伝子に由来するエレメント、または機能的に連結された遺伝子がこのような特徴を示すように構築された合成エレメントが含まれる。 転写制御エレメントが得られる好ましい遺伝子の特徴には、静止状態の細胞において低発現または検出不可能に発現されること、細胞外刺激の数分以内に転写レベルが迅速に誘導されること、一過的な、かつ新たなタンパク質合成とは無関係に誘導され、後の転写停止が新たなタンパク質合成を必要とすること、これらの遺伝子から転写されるmRNAsの半減期が短いことが含まれるが、これに限定されない。 これらの特性の全てが存在する必要はない。 さらに他の態様において、検出工程は、無細胞系、例えば、細胞溶解産物または精製もしくは半精製されたタンパク質もしくは核酸調製物の形で設けられる。 組換え宿主細胞から得られた試料を、タンパク質間相互作用、タンパク質-核酸相互作用、タンパク質-リガンド相互作用、核酸-核酸相互作用などが関与する、このような2つ一組の複合体 「標的複合体」 を阻害するまたは増強するような活性について試験することができる。 アッセイは、例えば、複合体の一方または両方の分子に関連する内因活性または異種活性によって、標的複合体の獲得または損失を検出することができる。 無細胞系、例えば、精製または半精製されたタンパク質を用いて得ることができる無細胞系において行われるアッセイは、分子標的が試験試料と接触された時に、迅速に進展し、分子標的変化を比較的容易に検出できるように作製できるので、「一次」スクリーニングとして好ましいことが多い。 2つ一組の複合体の検出および定量は、複合体の形成の阻害 または増強 における試験試料の効力を求める手段を提供する。 化合物の効力は、様々な濃度の試験試料を用いて得られたデータから用量反応曲線を作成することによって評価することができる。 さらに、比較のためのベースラインを得るために、対照アッセイも行うことができる。 例えば、対照アッセイでは、非形質転換宿主細胞からの条件培地を添加することができる。 標的複合体の量は様々な技法によって検出することができる。 例えば、複合体形成の調整は、例えば、検出可能に標識された 例えば、放射標識された、蛍光標識された、もしくは酵素標識された タンパク質などを用いて、イムノアッセイによって、またはクロマトグラフィー検出によって定量することができる。 さらに他の態様において、精製または半精製された酵素を用いて、試験試料をアッセイすることができる。 酵素活性を阻害または増強する試験試料の能力は、都合よく、その酵素の基質の変換速度を追跡することによって検出することができる。 さらに他の態様では、検出工程は、異種ゲノム配列の発現の副産物が誘導された宿主細胞における表現型変化を検出するように設計することができる。 前述の細胞をベースとするアッセイ形式の多くはまた、宿主細胞において、例えば、オートクラインに似た様式で使用することもできる。 検出工程は、組換え宿主細胞によって産生された生物学的に活性な分子を単離するための基礎となることに加えて、関心対象の生合成経路をコードする遺伝子を含むゲノムクローンを同定するのにも使用することができる。 本スクリーニング方法は、例えば、ヒト成分を用いて得られた検出アッセイの試験試料の効力と、例えば、真菌成分または細菌成分から得られた検出アッセイの効力を比較する、ディファレンシャルな形式で行うことができる。 従って、殺菌剤または殺真菌剤としての選択性が選択プロトコールにおける判断基準でもよい。 宿主株は、本方法が成功するために高レベルの新規化合物を産生する必要はない。 遺伝子の発現は最適でなくてもよく、包括的な調節因子が存在しなくてもよく、代謝産物プールが産物の最大産生を支持しなくてもよい。 代謝産物を検出する能力は、多くの場合、特に、バイオアッセイが少量の天然物に対して感度がある場合、最大レベルの産生を必要としない。 従って、最大下での初期の化合物産生が、本方法の成功に対する制限である必要はない。 最後に、前記のように、試験試料は、例えば、条件培地または細胞溶解産物から得られてもよい。 後者に関して、ある特定の場合では、宿主細胞から適切に排出されてなくてもよい異種発現化合物があってもよいことが予期される。 細胞溶解のために、当技術分野において利用可能な様々な技法がある。 好ましいアプローチ、すなわち、宿主細胞特異的な溶解因子の使用は本発明の別の局面である。 同様に、ラン藻類ファージを使用して、ラン藻類、例えば、シネココッカス属およびプロクロロコッカス属 Prochlorococcus を選択的に溶解することができる。 このようなファージを、増殖した宿主細胞培養物に添加すると、細胞内の新たな生合成経路の異種産物への接近を最大にすることができる。 さらに、このような因子は、宿主細胞ライブラリーと共に共培養され得る、試験生物、例えば、ヒト細胞の増殖を妨害しない。 代謝最適化 最適化プロセスの一部として、本発明はまた、炭素およびエネルギーを消費し得るが、有用な産物 例えば、炭化水素、ワックスエステル、界面活性剤、および他の炭化水素産物 を産生しない望ましくない副反応がもしあれば、これを排除する工程を提供する。 これらの工程は、望ましい産物の収率を改善するのに役立つ可能性がある点で有益であり得る。 異なるアプローチの組み合わせが用いられてもよい。 このようなアプローチには、例えば、メタボロミクス 細胞内に蓄積する望ましくない産物および代謝中間体を同定するのに用いられ得る 、代謝モデリングおよび同位体標識 炭化水素産生に寄与する代謝反応を介したフラックスを確かめる 、ならびに従来の遺伝的技法 不要な代謝反応を排除する、または実質的に無能にする が含まれる。 例えば、代謝モデリングは、細胞の代謝経路を介したフラックスを定量し、重要な代謝段階の排除の影響を確かめる手段を提供する。 さらに、メタボロミクスおよび代謝モデリングによって、望ましい産物の産生に及ぼす重要な代謝段階の排除の影響をさらに深く理解することができる。 特定の代謝操作が望ましい産物の細胞代謝および合成にどのように影響を及ぼすかを予測するために、公知の細胞代謝経路を介したモル流束 molar flux を説明する理論フレームワークが開発された。 この理論フレームワークのいくつかの重要な局面には、 i 公知の経路の比較的完全なデータベース、 ii 細胞組成物およびエネルギー要件の増殖速度に依存する組込み、 iii 異なる増殖速度および希釈率でのタンパク質のアミノ酸組成および膜の脂肪酸組成の実験測定、ならびに iv 代謝操作の結果として生じることが知られている副反応の実験測定が含まれる。 これらの新たな開発によって、重要な代謝経路におけるフラックスおよび酵素活性の調節をより正確に予測することが可能になる。 このようなタイプのモデルは、例えば、廃水処理リアクター内で、強化された生物学的リン除去を担う生物、およびポリケチド産生糸状菌における代謝フラックスを分析するために適用されている。 例えば、を参照されたい。 産物 本発明における高光合成生物は、生物学的糖、炭化水素産物、固形、および薬を含むが、これに限定されない産物カテゴリーを生じるように操作することができる。 生物学的糖には、グルコース、デンプン、セルロース、ヘミセルロース、グリコーゲン、キシロース、デキストロース、フルクトース、ラクトース、フルクトース、ガラクトース、ウロン酸、マルトース、およびポリケチドが含まれるが、これに限定されない。 好ましい態様において、生物学的糖は、グリコーゲン、デンプン、またはセルロースでもよい。 セルロースは、陸生生体バイオマスの最も豊富な形態である Crawford, R. 1981. Lignin biodegradation and transformation, John Wiley and Sons, New York. セルロース、特に、コットンリンターはニトロセルロース製造に用いられる。 セルロースはまた、紙の主要な構成成分でもある。 セルロースは直鎖である コイルは生じない。 ミクロフィブリル中で、複数の水酸基 hydroxide group が互いに水素結合しており、これは、鎖を堅固に保ち、高い引張り強度の一因となっている。 ヘミセルロースは、数種類のヘテロポリマーのうちのいずれでもよい植物細胞壁多糖の一つのクラスである。 これらには、キシラン、キシログルカン、アラビノキシラン、アラビノガラクタン、グルクロノキシラン、グルコマンナン、およびガラクトマンナンが含まれる。 このクラスの多糖は、ほとんど全ての細胞壁においてセルロースと共に見出される。 ヘミセルロースはセルロースより重量が小さく、温水またはキレート剤によって抽出することはできないが、アルカリ水溶液によって抽出することができる。 ポリマー鎖はペクチンおよびセルロースに結合して、架橋繊維の網目を形成する。 本質的に3つのタイプの炭化水素産物: 1 少なくとも1つの芳香環を有する、芳香族炭化水素産物; 2 二重結合、三重結合、または芳香族結合の無い、飽和炭化水素産物;および 3 炭素原子間の1つまたは複数の二重結合または三重結合を有する、不飽和炭化水素産物がある。 「炭化水素産物」は、C、H、任意でOからなり、炭素骨格に水素原子および酸素原子が結合している化合物とさらに定義されてもよい。 酸素は骨格に単結合または二重結合していてもよく、水素が結合していてもよい。 エーテルおよびエステルの場合、酸素は骨格に組み込まれていてもよく、炭素鎖に2つの単結合によって連結されてもよい。 1個の炭素原子が1つまたは複数の酸素原子に結合してもよい。 炭化水素産物はまた、前記の化合物が、タンパク質、コエンザイムAおよびアセチルコエンザイムAを含む生物学的薬剤に結合していてもよい。 炭化水素産物には、炭化水素、アルコール、アルデヒド、カルボン酸、エーテル、エステル、カロテノイド、およびケトンが含まれるが、これに限定されない。 ある好ましい態様では、炭化水素産物は、アルカン、アルコール、界面活性剤、ワックスエステル、およびその組み合わせである。 他の炭化水素産物には、脂肪酸、アセチル-CoA結合炭化水素、アセチル-CoA結合炭水化物、およびポリケチド中間体が含まれる。 組換え生物は、広範囲のサイズにわたる炭化水素産物および中間体を産生するように操作することができる。 産生することができる特定のアルカンには、例えば、エタン、プロパン、ブタン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカン、ウンデカン、ドデカン、トリデカン、テトラデカン、ペンタデカン、ヘキサデカン、ヘプタデカン、およびオクタデカンが含まれる。 好ましい態様において、炭化水素産物は、オクタン、デカン、ドデカン、テトラデカン、およびヘキサデカンである。 産生することができる炭化水素前駆体、例えば、アルコールには、例えば、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノール、デカノール、ウンデカノール、ドデカノール、トリデカノール、テトラデカノール、ペンタデカノール、ヘキサデカノール、ヘプタデカノール、およびオクタデカノールが含まれる。 より好ましい態様において、アルコールは、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノール、およびデカノールより選択される。 界面活性剤は、洗剤および洗浄剤を含めて様々な製品に用いられており、また、織物、革、紙の添加剤として、化学プロセスにおいて、化粧品および薬において、食品産業および農業において用いられる。 さらに、界面活性剤は、環境にアクセスすることが難しいと分かっている原油の抽出および単離を助けるために、または水エマルジョンとして用いられることがある。 用途の違いによって特徴付けられる、4つのタイプの界面活性剤がある。 陰イオン界面活性剤は洗剤様活性を有し、一般的に、洗浄用途に用いられる。 陽イオン界面活性剤は長鎖炭化水素を含有し、多くの場合、タンパク質を処理するのに用いられ、合成ポリマーは、柔軟仕上げ剤およびヘアコンディショナーの成分である。 両性界面活性剤も長鎖炭化水素を含有し、典型的にはシャンプーに用いられる。 非イオン界面活性剤は一般的に洗浄用製品に用いられる。 さらに、炭化水素はバイオ燃料として産生されることがある。 バイオ燃料は、生物学的供給源-最近まで生きていた生物またはその代謝副産物、例えば、牛のふんに由来する任意の燃料である。 バイオ燃料は、生物の代謝産物に由来する燃料とさらに定義されてもよい。 好ましいバイオ燃料は、バイオディーゼル、バイオ原油 biocrude 、エタノール、「再生可能な石油 renewable petroleum 」、ブタノール、およびプロパンを含むが、これに限定されない。 固形炭素には、例えば、石炭、黒鉛、グラフェン、セメント、カーボンナノチューブ、カーボンブラック、ダイアモンド、および真珠が含まれる。 石炭およびダイアモンドなどの純粋な炭素固体が好ましい固形である。 例えば、イソプレノイドベースのタキソールおよびアルテミシニン、またはオセルタミビルを含めて、薬を産生することができる。 プラスミド構築pJB5ベースプラスミドの構築 シネココッカス属の種PCC7002への組換えのために、pJB5ベースプラスミドを空の発現ベクターとして設計した。 2つの相同性領域である上流相同性領域 UHR および下流相同性領域 DHR を、関心対象のクローニングされた遺伝子に隣接するように設計した。 組み込まれた構築物にスペクチノマイシン耐性およびストレプトマイシン耐性を付与するために、aadAプロモーター、遺伝子配列、およびターミネーターを設計した。 発現用に、aph2カナマイシン耐性カセットプロモーターおよびリボソーム結合部位 RBS を用いて、pJB5を設計した。 このプロモーターおよびRBSの下流に、本発明者らは、NdeIおよびEcoRIの制限エンドヌクレアーゼ認識部位、ならびにXhoI部位、BamHI部位、SpeI部位、およびPacI部位を設計および挿入した。 EcoRI部位の後に、ザイモモナス・モビリス Zymomonas mobilis adhII ターミネーターからの、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来の天然ターミネーターを含めた。 便利なXbaI制限部位がUHRおよびDHRに隣接するので、組換えしようとするDNAを、ベクターの残りから切断することができる。 pJB5、pJB6、およびpJB7は、DNA2. 0 Menlo Park, CA が構築した。 pJB161ベースプラスミドの構築 pJB5ベースプラスミドを補うために、pJB161ベースプラスミドを設計したが、2つの遺伝子を同時にシネココッカス属の種PCC7002に組み込むために異なる組込み部位および耐性マーカーがある。 pJB5に由来するUHRおよびDHRを、シネココッカス属の種PCC7002の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子に隣接する領域と置換した。 新たなldh-UHRおよびldh-DHRをPCR増幅した。 PCRに使用したプライマーは、以下の通り::lac-UHR用フォワードプライマー-、lac-UHR用下流プライマー-;lac-DHR用上流プライマー-、lac-DHR用下流プライマー-であった。 lac-UHR用上流プライマーによってSbfI制限エンドヌクレアーゼ部位が付加され、lac-UHR用下流プライマーによってNotI制限部位が付加され、lac-DHR用上流プライマーによってAscI制限部位が付加され、lac-DHR用下流プライマーによってFseI制限部位が付加された。 高忠実度Phusion DNA Polymerase Master Mix New England Biolabs, Beverly, MA を用いて、相同性領域を、シネココッカス属の種PCC7002ゲノムDNAから増幅した。 増幅されたldh-DHR領域およびpJB5プラスミドを、FseIおよびAscI New England Biolabs 制限エンドヌクレアーゼを用いた周知の実験法を用いて個々に消化した。 結果とした生じたDNA断片を、公表された技法から逸脱することなく、1%TAEアガロースゲル上でゲル単離し、Gel Isolation Kit Qiagen を用いて精製し、Quick Ligation Kit New England Biolabs を用いて連結した。 連結された産物により、標準的な技法を用いて、化学的にコンピテントなEPI400 EpiCentre 登録商標 細胞を形質転換し、連結された産物をPCRによって確認した。 結果とした生じたプラスミドを、ldh-UHR領域を組み込むために、もう1回クローニングに供した。 増幅されたldh-UHR領域および新たに構築されたプラスミドを、SbfIおよびNotI New England Biolabs 制限エンドヌクレアーゼを用いた周知の実験法を用いて個々に消化した。 両消化物を、公表された技法から逸脱することなく、1%TAEアガロースゲル上でゲル単離し、Gel Isolation Kit Qiagen を用いて精製し、Quick Ligation Kit New England Biolabs を用いて連結した。 連結された産物により、標準的な技法を用いて、化学的にコンピテントなEPI400細胞 EpiCentre を形質転換し、連結された産物をPCRによって確認した。 結果とした生じたプラスミド、pJB165を、PCRおよび制限消化によって確認した。 カセットはDNA2. 0 Menlo Park, CA が構築した。 このカセットとpJB165を、PacIおよびAscI New England Biolabs 制限エンドヌクレアーゼを用いた周知の実験法を用いて個々に消化した。 両消化物を、公表された技法から逸脱することなく、1%TAEアガロースゲル上でゲル単離し、Gel Isolation Kit Qiagen を用いて精製し、Quick Ligation Kit New England Biolabs を用いて連結した。 連結された産物により、標準的な技法を用いて、化学的にコンピテントなEPI400細胞 EpiCentre を形質転換した。 結果とした生じたプラスミドpJB161を、PCRによって、および形質転換コロニーの抗生物質カナマイシン耐性によって確認した。 pJB5-PdcAdhIIおよびJCC136の構築 以下の手順を用いて、ピルビン酸デカルボキシラーゼ pdc およびアルコールデヒドロゲナーゼ adhII 遺伝子をpJB5プラスミドにクローニングした。 ザイモモナス・モビリス GenBank:DD161475、M15394 からのpdc-adhII遺伝子を、NdeI部位がpdcコード領域の開始に取って代わるように設計した。 pdc遺伝子の後に、本発明者らは、2つの制限エンドヌクレアーゼ部位 XhoIおよびBamHI を設計した。 次に、adhII配列全体を制限部位の後に設計し、最後に、挿入されたEcoRI部位の下流に天然adhIIターミネーターも含めた。 この構築物はDNA2. 0 Menlo Park, CA が構築し、pJB5およびインサート上でのNdeIおよびEcoRI New England Biolabs; Ipswitch、MA による制限消化によって挿入し、その後に、Quick Ligation Kit New England Biolabs;Ipswitch, MA を用いて連結した。 標準的な手順を用いた、pJB5-PdcAdhIIによるシネココッカス属の種PCC7002の形質転換 簡単に述べると、シネココッカス属の種PCC7002を、Frigaard NU et al. 2004 「Gene inactivation in the cyanobacterium Synechococcus sp. 0まで48時間、コロニーから増殖させた。 耐性コロニーは7〜10日間生存した。 コロニーをPCRによってスクリーニングした。 結果とした生じた株をJCC136と名付けた。 シネコシスティス属の種PCC6803のglgA遺伝子の750bp上流および下流に、glgA-UHRおよびglgA-DHRを設計した。 glgA-UHRおよびglgA-DHRは、SbfIおよびNotI制限エンドヌクレアーゼ部位ならびにPacIおよびAscI制限エンドヌクレアーゼ部位が隣接し、後で、これらの間で消化しやすくなるように配列スペーサーを付けて設計した。 この構築物はDNA2. 0 Menlo Park, CA が構築した。 このカセットとpJB5-PdcAdhIIを、NotIおよびAscI New England Biolabs 制限エンドヌクレアーゼを用いた周知の実験法を用いて個々に消化した。 両消化物を、公表された技法から逸脱することなく、1%TAEアガロースゲル上でゲル単離し、Gel Isolation Kit Qiagen を用いて精製し、Quick Ligation Kit New England Biolabs を用いて連結した。 連結された産物により、標準的な技法を用いて、化学的にコンピテントなEPI400細胞 EpiCentre を形質転換した。 結果とした生じたプラスミドpJB263を、PCRによって、および形質転換コロニーの抗生物質スペクチノマイシン耐性によって確認した。 実施例 本明細書において提供される実施例は、本発明をさらに詳細に例示する。 これらの実施例は、当業者が本発明の様々な局面を理解および実施する助けとなるように提供され、従って、限定するものであると解釈すべきでない。 本明細書に記載のものに加えて、本発明の様々な変更および拡張は当業者に明らかであり、従って、このような変更および拡張は本発明の範囲内にある。 実施例1:光捕獲の改善 光合成生物は、光を効率的に捕獲する精巧な方法を進化させてきた。 この方法は、しばしば、光合成生物の自然生息地を制限している。 真核生物の光独立栄養生物は、光エネルギーを捕獲し、光合成反応中心に送る集光性複合体 LHC として知られる、クロロフィルおよびカロテノイド結合タンパク質のスーパーファミリーをコードする[Green BR and Durnford DG. 「The chlorophyll-carotenoid proteins of oxygenic photosynthesis. 」 Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 1996. 47:685-714]。 クロロフィル分子は、具体的には、いわゆる「アンテナ」構造で並べられている。 反応中心1個あたりのクロロフィル分子の数は、光化学系II PSII では反応中心1個あたり350超のクロロフィルaおよびクロロフィルb分子、ならびに光化学系I PSI では300のクロロフィルa分子を含めて、大幅に異なる場合がある。 アンテナは、全く新しいタンパク質ベースの反応中心および付随する電子輸送系を作る必要なく光吸収スペクトルを高める手段を提供する。 大きなアンテナは、自然において生物に生存上の利益をもたらす。 しかしながら、高い光強度の条件下では、大きなアンテナは過剰な光子を吸収し、蛍光または熱として無駄に放散しなければならない。 一重項状態の励起クロロフィル分子を安全に放散し損なうと、極めて有害な活性酸素種である一重項酸素が形成することがある[Muller P, Li X, Niyogi KK. 「Non-photochemical quenching. A response to excess light energy. 」Plant Physiology 2001. 125:1558-66]。 生物は、天然では、光条件の変化に対する適応応答としてクロロフィルアンテナサイズを大きくする、または小さくする[Falkowski PG and Owens TG. 「Light-shade adaptation. 」 Plant Physiol 1980. 「Contrasting behavior of higher plant photosystem I and II antenna systems during acclimation. 」 J Biol Chem 2007. 282 12 :8947-58]。 最近、tla1またはLHCタンパク質ファミリー全体[Mussgnug JH, Thomas-Hall S, Rupprecht J, Foo A, Klassen V, McDowall A, Schenk PM, Kruse O, and Hankamer B. 「Engineering photosynthetic light capture: impacts on improved solar energy to biomass conversion. 」 2007. 5 6 :802-14]を下方制御することによって、微細藻類の通常は動的なアンテナサイズを遺伝的に永久に縮めることができることが証明された。 より小さなアンテナを有する株は、特に、高光束下では、細胞遮光 cell shading の低下および生産性の向上を示す。 緑色硫黄光合成細菌および緑色非硫黄光合成細菌の集光性アンテナであるクロロソームは、特殊化したリポタンパク質区画、典型的には、バクテリオクロロフィル BChl c、BChla、カロテノイド、およびキノンを含む区画である[Frigaard NU, Li H, Milks KJ, and Bryant DA. 「Nine mutants of Chlorobium tepidum each unable to synthesize a different chlorosome protein still assemble functional chlorosomes. J Bacteriol 2004. 186 3 :636-53]。 天然では、クロロソームは、極めて弱い光条件下での増殖を可能にするので、緑色細菌に大きな生存上の利益をもたらす。 アンテナ構造は、BChlc合成酵素 bchK を不活性化することによって排除することができる[Friggard NU, Voigt GD, and Bryant DA. 「Chlorobium tepidum mutant lacking bacteriochlorophyll c made by inactivation of the bchK gene, encoding bacteriochlorophyll c synthase. 」 J Bacteriol 2002. 184 12 :3368-76]。 ラン藻類および赤色藻類の集光性アンテナであるフィコビリソームは、主に、フィコビリンタンパク質であるフィコエリトリン、フィコシアニン、およびアロフィコシアニンからなる[Grossman AR, Schaefer MR, Chiang GG, and Collier JL. 「The phycobilisome, a light-harvesting complex responsive to environmental conditions. 」 Microbiol Rev 1993. 57 3 :725-49]。 植物、藻類、および緑色細菌の集光性アンテナと同様に、フィコビリソームはラン藻類では完全に必要ない。 光独立栄養生物は、光エネルギーを、化学エネルギー プロトン輸送力 PMF により動くATP合成酵素を介して、ATPの形で および還元力 NADPH に変換するために光合成反応中心を常に利用しているが、古細菌ロドプシン様タンパク質 バクテリオロドプシン によって例示されるように、光活性化プロトン移行系を用いる公知の光独立栄養生物はない[Oesterhelt D and Stoeckenius W. 「Rhodopsin-like protein from the purple membrane of Halobacterium halobium. 」 Nature New Biol 1971. 233 39 :149-52]。 それにもかかわらず、関連配列が、細菌において光駆動エネルギー発生 光従属栄養 を媒介することが明確に示されている。 本発明は、光独立栄養体における1つまたは複数の形の光駆動プロトンポンプの外因性発現が、光エネルギーをPMFに変換する並行手段を提供することによって生物効率を高めることを開示する。 PMFは、膜を通過する分子の能動輸送を動かすか、または内因性もしくは外因性ATP合成酵素を介してATPを発生させるのに使用することができる。 輸送は、細胞増殖間の全エネルギーの15〜25%を消費すると見積もられている[Stouthamer AH. 「A theoretical study on the amount of ATP required for synthesis of microbial cell material. 」 Antonie Van Leeuwenhoek 1973. 39 3 :545-65; Carruthers A. 「Mechanisms for the facilitated diffusion of substrates across cell membranes. 」 Biochemistry 1991. 30 16 :3898-906]。 プロテオロドプシン PR 遺伝子が生物において優先的に発現される。 例示的なPR配列は、Martinerz A, Bradley AS, Walbauer JR, Summons RE, DeLong EF. PNAS 2007. 「Proteorhodopsin photosystem gene expression enables photophosphorylation in a heterologous host. 」 104 13 :5590-5595に記載の遺伝子座ABL60988である。 さらに、もしくはその代わりとして、バクテリオロドプシン遺伝子が発現される[Oesterhelt D, Stoeckenius W. Nature 1971 「Rhodopsin-like protein from the purple membrane of Halobacterium halobium. 」 233:149-152]。 例示的なバクテリオロドプシン配列は、Ng WV et al. PNAS 2000. 「Genome sequence of Halobacterium species NRC-1. 以前に、バクテリオロドプシンは、酵母ミトコンドリアにおいて機能的に発現されている [Hoffmann A, Hildebrandt V, Heberle J, Buldt G. 「Photoactive mitochondria: In vivo transfer of a light-driven proton pump into the inner mitochondrial membrane of Schizosaccharomyces pombe. 」 Proc. Natl. Acad. Sci 1994. 91: 9637-71]。 同様に、これに加えて、もしくはその代わりとして、デルタロドプシン deltarhodopsin が発現される。 例示的なデルタロドプシン配列は、Ihara K et al. J Mol Biol 1999 「Evolution of the archael rhodopsins: evolution rate changes by gene duplication and functional differentiation. 」285:163-174に記載の、ハロテリゲナ Haloterrigena の種のArg-4のAB009620 遺伝子座である。 同様に、他のプロトンポンプに加えて、もしくはその代わりとして、レプトスフェリア・マクランス Leptosphaeria maculans オプシンタンパク質が発現される。 例示的な真核生物の光活性化プロトンポンプは、Waschuk SA, Benzerra AG, Shi L, and Brown LS. PNAS 2005. 「Leptosphaeria rhodopsin: Bacteriorhodopsin-like proton pump from a eukaryote. 」102 19 :6879-83]に記載の、レプトスフェリア・マクランスに由来するオプシン、アクセッション番号AAG01180である。 最後に、他のプロトンポンプに加えてもしくはその代わりとして、キサントロドプシンプロトンポンプとカロテノイドアンテナが発現される Balashov SP, Imasheva ES, Boichenko VA, Anton J, Wang JM, Lanyi JK. Science 2005 「Xanthorhodopsin: A proton pump with a light harvesting cartenoid antenna. 」 309 5743 : 2061-2064。 例示的なキサントロドプシン配列は、Mongodin EF et al. PNAS 2005. 「The genome of Salinibacter ruber: Convergence and gene exchange among hyperhalophilic bacteria and archaea. 」102 50 :18147-18152に記載のサリニバクター・ルーバー Salinibacter ruber DSM 13855に由来する遺伝子座ABC44767である。 これらのポンプは単独で、または組み合わせて用いられ、特定の細胞に最適化される。 キサントロドプシンおよびプロテオロドプシンの同時発現が最適な組み合わせである。 前記の1つまたは複数のプロトンポンプの発現に加えて、レチナール生合成経路が発現される。 PRおよびレチナール生合成オペロンが大腸菌において機能的に発現されると、ポンプは、アジド処理された大腸菌集団にプロトン輸送力を回復することができる[Walter JM, Greenfield D, Bustamante C, Liphardt J. PNAS 2007. 「Light-powering Escherichia coli with proteorhodopsin. 」 104 7 :2408-2412]。 6遺伝子レチナール生合成オペロン、アクセッション番号 EF100190が公知であり Martinerz A, Bradley AS, Walbauer JR, Summons RE, DeLong EF. PNAS 2007. 「Proteorhodopsin photosystem gene expression enables photophosphorylation in a heterologous host. 32、遺伝子座ABL60985;フィトエンデヒドロゲナーゼ CrtI 、遺伝子座ABL60986;およびゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素 CrtE 、遺伝子座ABL60987をコードする。 前記の6つの酵素は、全てのロドプシン関連プロトンポンプに共通にある必須の発色団であるレチナールの合成を可能にする。 ある特定の態様において、キサントロドプシンポンプおよびC-40サリニキサンチンアンテナによって例示されるように、カロテノイドによって、さらなるスペクトル吸収が提供される。 ある特定の態様において、PMFをATPに最大限に変換するために、内因性または外因性のATP合成酵素 EC3. 14 が過剰発現される。 例示的なATP合成酵素は、大腸菌に由来するF1-F0ATP合成酵素である。 好ましい態様では、適応、進化、または操作の前に、野生型生物より小さな集光性アンテナを含有するように以前に適応、進化、または操作された生物内において、1つまたは複数の細胞膜の状況で光駆動プロトンポンプが発現される。 このような生物は、特に、高光束下で繁殖された時に、光エネルギーから細胞エネルギー、バイオマス、および産物への変換が他に類を見ないほど効率がよい。 光捕獲モジュールのプロテオロドプシンをコードするSAR86遺伝子の発現 本明細書で使用するSAR86プロテオロドプシン遺伝子 Beja, et al. Science 2000 vol. 289: 1902-1906; GenBank: AF279106 は、Jessica WaltersおよびJan Liphardt University of California, Berkeley によって以前に構築および提供されたプラスミドから入手した。 Walters-Liphardtプラスミドから、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含むPCRプライマーを用いて、プロテオロドプシン遺伝子を増幅した。 PCR増幅は、高忠実度Phusion DNA Polymerase Master Mix New England Biolabs, Beverly, MA を用いて行った。 フォワードプライマーによりNdeI制限認識部位が付加され、リバースプライマーにより停止コドンおよびMfeI制限認識部位が付加される。 増幅されたプロテオロドプシンPCR遺伝子産物をpJB5発現ベクター 「pJB5-PR」 に、NdeIおよびMfeI New England Biolabs 制限エンドヌクレアーゼを用いた周知の実験法を用いてインサートおよびベクターを個々に消化することによってクローニングした。 両消化物を、公表された技法から逸脱することなく、1%TAEアガロースゲル上でゲル単離し、Gel Isolation Kit Qiagen を用いて精製し、Quick Ligation Kit New England Biolabs を用いて連結した。 連結された産物により、標準的な技法を用いて、化学的にコンピテントなEPI400細胞 EpiCentre を形質転換し、これをPCRによって確認した。 シネココッカス属の種PCC7002を形質転換するために、pJB5-PRプラスミドストックを、Qiagenミニプレップキットを用いて精製した。 標的シネココッカス属宿主細胞への組込みは、「コロニーPCR」プロトコールによる全細胞ゲノムDNAのPCRによって確認した。 PCRは、コロニーの正しいバンドを示した。 この株をJCC1-SAR86 図10、レーン5 と名付けた。 実施例2:CO2固定の改善 独立栄養炭素固定を可能にする4つの公知の経路:3-ヒドロキシプロプリオン酸 hydroxyproprionate 3-HPA 回路 クロロフレクサス・アウランチアカス Chloroflexus aurantiacus およびクレナルカエオタ・シムビオサム Crenarchaeota symbiosum によって用いられる 、還元的TCA回路 クロロビウム・テピダムによって用いられる 、還元的アセチルコエンザイムA経路 ウッド-ユングダール経路とも知られる;化学合成独立栄養体 chemolithoautotroph 、例えば、クロストリジウム・サーモアセチカム Clostridium thermoaceticum 、メタノバクテリウム・サーマウトトロフィカム Methanobacterium thermautotrophicum 、およびダスルフォバクテリウム・アウトロフィカム Dusulfobacterium autotrophicum によって用いられる 、ならびに還元的ペントースリン酸回路 カルビン回路とも知られる、植物、藻類、および全てのラン藻類によって用いられる がある。 定義により、全ての光独立栄養生物は、無機CO2を、糖などの複雑な還元有機炭素分子に固定する能力を有する。 または、もしくはさらに、宿主の内因性CO2固定経路に1つまたは複数の外因性CO2固定酵素または経路を加えることによって、機能改善が加えられる。 操作された生物は野生型対応物より速く複製する。 タバコ葉における2つのカルビン回路酵素の過剰発現は、野生型植物と比較して成長を速めることが以前に示されている[Tamoi M, Nagaoka M, Yabuta Y, and Shigeoka S. 「Carbon metabolism in the Calvin cycle. 」 Plant Biotechnology 2005. 22:355-360]。 この変換は、光独立栄養生物の倍加時間を支配する制限局面であると考えられる。 表1は、炭素固定の速度および効率を上げるために過剰発現される遺伝子と、関連する経路、酵素委員会 EC 番号、例示的な遺伝子名、供給源生物、GenBankアクセッション番号、および代替の供給源に由来するホモログに関する情報を列挙している。 親の生物が、示された酵素活性を有する遺伝子をコードする場合でも、CO2固定を改善するために、これらの成分を過剰発現することが有用である。 1つの態様において、天然の酵素配列が過剰発現される。 好ましい態様では外因性遺伝子を過剰発現することが有用であり、これにより、バイオプロセスにおいてより明確な調節制御、および天然遺伝子に明確に焦点を当てた、中心代謝調節の影響を潜在的に和らげる手段が可能になる。 機能的な3-ヒドロキシプロピオン酸回路の酵素 機能的な3-ヒドロキシプロピオン酸回路を確立するために、以下の酵素活性が発現される。 J Bacteriol 2001. 「Autotrophic CO2 fixation by Chloroflexus aurantiacus: study of glyoxylate formation and assimilation via the 3-hydroxypropionate cycle. 」 183 14 :4305-16]。 アセチル-CoAカルボキシラーゼ ACCアーゼ 、 EC6. 2 は、アセチル-CoA、CO2、およびATPから、マロニルCoA、ADP、およびPiを生成する。 例示的なビオチン-カルボキシル担体タンパク質は、大腸菌に由来するaccB、遺伝子座ECOACOACである。 例示的なビオチンカルボキシラーゼは、大腸菌に由来するaccC、遺伝子座AAA23748である。 マロニルCoA還元酵素 3-ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼとも知られる EC1. アルコール活性およびデヒドロゲナーゼ活性の両方を有する例示的な二機能酵素は、クロロフレクサス・アウランチアカスに由来するmcr、遺伝子座AY530019である。 例示的な遺伝子は、クロロフレクサス・アウランチアカスに由来するプロピオニル-CoA合成酵素 pcs 、遺伝子座AF445079である。 プロピオニル-CoAカルボキシラーゼ EC6. 3 は、プロピオニル-CoA、ATP、およびCO2からS-メチルマロニル-CoA、ADP、およびPi 無機リン酸 を生成する。 メチルマロニル-CoAエピメラーゼ EC5. 1 は、S-メチルマロニル-CoAからR-メチルマロニル-CoAを生成する。 ロドバクター・スフェロイデス Rhodobacter sphaeroides に由来する例示的な酵素は、遺伝子座CP000661である。 メチルマロニル-CoAムターゼ EC5. 2 は、R-メチルマロニル-CoAからスクシニル-CoAを生成する。 一例は、yliKタンパク質 遺伝子座NC000913. 2 である。 スクシニル-CoA:L-リンゴ酸CoAトランスフェラーゼは、スクシニル-CoAおよびリンゴ酸からL-マリル-CoAおよびコハク酸を生成する。 例示的な2サブユニット酵素は、クロロフレクサス・アウランチアカスに由来するSmtA、遺伝子座DQ472736. 1、およびクロロフレクサス・アウランチアカスに由来するSmtB、遺伝子座DQ472737. 1である。 フマル酸還元酵素 EC1. 例示的なフマル酸還元酵素は、大腸菌frdオペロン 遺伝子座J01611 である。 frdAフマル酸還元酵素フラビンタンパク質サブユニットが公知である。 一部の種は他の種より一方向を好む場合があることに留意することが重要である。 さらに、これらのタンパク質の多くは、一方向バージョンおよび二方向バージョンを発現する生物に存在する。 例は、frdB、フマル酸還元酵素鉄-硫黄サブユニット、およびg15サブユニットg13サブユニットである。 フマル酸ヒドラターゼ EC4. 2 は、フマル酸および水からリンゴ酸を生成する。 大腸菌は、3種類の別個の例示的なフマル酸ヒドラターゼ:クラスI好気性フマル酸ヒドラターゼ fumA 、遺伝子座CAA25204;クラスI嫌気性フマル酸ヒドラターゼ fumB 、遺伝子座AAA23827;クラスIIフマル酸ヒドラターゼ fumC 、遺伝子座CAA27698をコードする。 L-マリル-CoAリアーゼ EC4. 2 は、L-マリル-CoAからアセチル-CoAおよびグリオキシル酸を生成する。 1である。 このセクションにおいて列挙した前記の酵素活性は、2つのCO2分子から、有機2-炭素グリオキシル酸分子を合成する能力を付与する。 機能的な還元的TCA回路の酵素 機能的な還元的TCA回路を確立するために、以下の酵素活性が発現される。 この経路は、天然ではクロロビウム・テピダムによって用いられる。 ATP-クエン酸リアーゼ EC. 8 は、クエン酸、ATP、およびCoAから、アセチル-CoA、オキサロ酢酸、ADP、およびPiを生成する。 例示的なATPクエン酸リアーゼは、ATPクエン酸リアーゼサブユニット1、遺伝子座CY1089およびATPクエン酸リアーゼサブユニット2、遺伝子座CT1088を含む、クロロビウム・テピダムに由来する2サブユニット酵素である。 ヒドロゲノバクター・サーモフィラス Hydrogenobacter thermophilus は、クエン酸からオキサロ酢酸を生成する代替経路を用いる。 第1の段階では、2サブユニットシトリル-CoA合成酵素が、クエン酸、ATP、およびCoAからシトリル-CoAを生成する。 大サブユニット:ccsA、遺伝子座BAD17844;小サブユニット:ccsB、遺伝子座BAD17846。 ヒドロゲノバクター・サーモフィラスのシトリル-CoAリガーゼ ccI 、遺伝子座BAD17841は、シトリル-CoAからオキサロ酢酸およびアセチル-CoAを生成する。 リンゴ酸デヒドロゲナーゼ EC1. クロロビウム・テピダムに由来する例示的なリンゴ酸デヒドロゲナーゼは、遺伝子座CAA56810である。 フマラーゼ フマル酸ヒドラターゼとも知られる EC4. 2 は、リンゴ酸からフマル酸および水を生成する。 大腸菌は3種類のフマラーゼ遺伝子をコードし、これらを光独立栄養生物において過剰発現することができる。 例示的な大腸菌フマラーゼヒドラターゼクラスI 好気性アイソザイム は、fumAである。 例示的な大腸菌フマル酸ヒドラターゼクラスI 嫌気性アイソザイム は、fumBである。 例示的な大腸菌フマル酸ヒドラターゼクラスIIは、fumCである。 コハク酸デヒドロゲナーゼ EC1. 大腸菌は、4サブユニットコハク酸デヒドロゲナーゼ複合体 SdhCDAB をコードする。 これらの酵素もまた前記の3-HPA経路において用いられるが、逆方向で用いられる。 一部の種は他の種より一方向を好む場合があることに留意することが重要である。 大腸菌において、順反応および逆反応は別個の複合体によって触媒され、フマル酸還元酵素は嫌気条件下で作動し、コハク酸デヒドロゲナーゼは好気条件下で作動する。 アセチル-CoA:コハク酸CoAトランスフェラーゼ スクシニル-CoA合成酵素とも知られる EC6. 5 は、コハク酸、CoA、およびATPから、スクシニル-CoA、ADP、およびPiを生成する。 クロロビウム・テピダムsucC AAM71626 およびsucD AAM71515 も使用することができる。 クロロビウム・リミコラ Chlorobium limicola DSM245に由来する例示的な酵素は、アクセッション番号EAM42575;EAM42574;EAM42853;およびEAM42852を有する4サブユニット酵素である。 この活性は大腸菌において機能的に発現された。 Yun NR, Arai H, Ishii M, Igarashi Y. Biochem Biophys Res Communic 2001. The Genes for anabolic 2-oxoglutarate:Ferredoxin oxidoreductases from Hydrogenobacter thermophilus TK-6. 282 2 :589-594。 同じ細菌には別の5サブユニットOGORクラスターがある。 Yun NR et al. Biochem Biophys Res Communic 2002. A novel five-subunit-type 2-oxoglutalate:ferredoxin oxidoreductases from Hydrogenobacter thermophilus TK6. 292 1 :280-6。 対応する遺伝子はDABGEである。 イソクエン酸デヒドロゲナーゼ EC1. 例示的な遺伝子は、クロロビウム・リミコラに由来する単量体型idh、遺伝子座EAM42635である。 別の例示的な酵素は、シネココッカス属の種WH8102、icd、アクセッションCAE06681に由来する酵素である。 41 が発現される。 例示的なNAD依存性酵素は、サッカロマイセス・セレビシエ Saccharomyces cerevisiae に由来する2サブユニットミトコンドリアバージョン、サブユニット1、idh1遺伝子座YNL037Cである。 第2のサブユニットは、idh2、遺伝子座YOR136Wである。 アコニターゼ アコニット酸ヒドラターゼまたはクエン酸ヒドロリアーゼとも知られる EC4. 3 は、cis-アコニット酸中間体を介してD-クエン酸からクエン酸を生成する。 大腸菌は、アコニット酸ヒドラターゼ1および2 acnAおよびacnB をコードする。 例示的なアコニット酸ヒドラーゼ1は、大腸菌acnA、遺伝子座b1276である。 例示的な大腸菌アコニット酸ヒドラターゼ2は、acnB、遺伝子座b0118である。 ピルビン酸合成酵素 ピルビン酸:フェレドキシン酸化還元酵素とも知られる EC1. 1 は、アセチル-CoA、CO2および還元型フェレドキシンから、ピルビン酸、CoA、および酸化型フェロドキシン ferrodoxin を生成する。 例示的なピルビン酸合成酵素は、破傷風菌 Clostridium tetani E88に由来する四量体酵素porABCDである。 サブユニットporA、遺伝子座AA036986;サブユニットporB、遺伝子座AA036985;サブユニットporC、遺伝子座AA036988;およびサブユニットporD、遺伝子座AA036987。 ホスホエノールピルビン酸合成酵素 PEP合成酵素、ピルビン酸、水ジキナーゼとも知られる EC2. 2 は、ピルビン酸、ATP、および水から、ホスホエノールピルビン酸、AMP、およびPiを生成する。 大腸菌は、例示的なPEP合成酵素、ppsAをコードする。 大腸菌ppsA酵素、遺伝子座AAA24319およびアクイフェクス・アエオリカス Aquifex aeolicus VF5に由来する対応する酵素ppsA、遺伝子座AAC07865も使用することができる。 ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ PEPカルボキシラーゼPEPCアーゼ、PEPCとも知られる EC4. 31 は、ホスホエノールピルビン酸、水、およびCO2から、オキサロ酢酸およびPiを生成する。 大腸菌は、例示的なPEPカルボキシラーゼ、ppCをコードする。 大腸菌ppC酵素、遺伝子座CAA29332も使用することができる。 このセクションに記載した前記の酵素は、2つのCO2分子から、有機2-炭素アセチル-CoA分子を合成する能力を付与する。 III. 機能的なウッド-ユングダール回路の酵素 機能的なウッド-ユングダール経路を確立するために、以下の酵素活性が発現される。 この経路は、天然では、ムーレラ・サーモアセチカ Moorella thermoacetica 以前は、クロストリジウム・サーモアセチカムとして知られる 、メタノバクテリウム・サーモアウトロフィカム Methanobacterium thermoautrophicum 、およびデスルフォバクテリウム・オートロフィカム Desulfobacterium autotrophicum によって用いられる。 NADP依存性ギ酸デヒドロゲナーゼ EC1. ギ酸テトラヒドロ葉酸リガーゼ EC6. 3 は、ギ酸、ATP、およびテトラヒドロ葉酸から、10-ホルミルテトラヒドロ葉酸、ADP、およびPiを生成する。 例示的なギ酸テトラヒドロ葉酸リガーゼは、クロストリジウム・アシジ-ウリシ Clostridium acidi-urici 遺伝子座M21507に由来する。 この酵素活性の代替の供給源には、ストレプトコッカス・ミュータンス Streptococcus mutans に由来する遺伝子座AAB49329 Swiss-ProtエントリーQ59925 、または遺伝子座BA000016によってコードされる、クロストリジウム・パーフリンゲンス Clostridium perfringens に由来するSwiss-ProtエントリーQ8XHL4を有するタンパク質が含まれる。 メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ 5,10-メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼとも知られる EC3. 9および1. この酵素活性の代替の供給源には、ムーレラ・サーモアセチカに由来する遺伝子座ABC19825 folD 、破傷風菌に由来する遺伝子座AAO36126;およびクロストリジウム・パーフリンゲンスに由来する遺伝子座BAB81529が含まれる。 全て二機能folD酵素である。 メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素 EC1. 大腸菌は、例示的なメチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素、metF、例えば、大腸菌酵素、遺伝子座CAA24747をコードする。 この酵素活性の代替の供給源には、インフルエンザ菌 Haemophilus influenzae に由来する遺伝子座AAC23094およびネズミチフス菌 Salmonella typhimurium に由来する遺伝子座CAA30531が含まれる。 例示的な遺伝子、acsEは、ムーレラ・サーモアセチカの遺伝子座AAA53548によってコードされる。 この活性は大腸菌において機能的に発現される Roberts DL, Zhao S, Doukov T, and Ragsdale S. Bacteriol 1994. 176 19 :6127-30。 この活性の代替の供給源は、カルボキシドサーマス・ヒドロゲノホルマス Carboxydothermus hydrogenoformas に由来するacsE遺伝子、遺伝子座CP000141によってコードされる。 2および2. 169 は二機能2サブユニット酵素であり、CO2、還元型フェレドキシン、およびメチル化コリノイドタンパク質から、アセチル-CoA、水、酸化型フェレドキシン、およびコリノイドタンパク質を生成する。 このセクションに記載した前記の酵素は、2つのCO2分子から、有機2-炭素アセチル-CoA分子を合成する能力を付与する。 機能的なCO2固定経路を含有するように操作された細胞は、有機炭素源を欠く最小培地での増殖を介して選択される。 生存に基づく選択に加えて、細胞を、放射標識CO2 すなわち、C14-CO2 の存在下で最小培地において増殖することができる。 当業者に公知の一般的な技法を用いて、代謝同化を検証および特徴付けるために、詳細な取り込み研究が用いられる。 機能的な還元的ペントースリン酸回路の酵素 機能的な還元的ペントースリン酸 カルビン 回路を確立するために、以下の酵素活性が発現される。 この経路は、天然では、全ての植物、藻類、およびラン藻類によって用いられる。 39 は、リブロース-1,5-二リン酸、CO2、およびH2Oから、2分子の3-ホスホグリセリン酸を生産的に生成する。 その名の通り、RuBisCoは非生産的酸素化反応を触媒することもできる。 いくつかのクラスのRuBisCoが公知であり、これらのいずれかおよび全てを過剰発現することができる[Watson GMF, Tabita FR. 」146 1 :13-22]。 例示的なルビスコアクチバーゼは、シネココッカス属の種JA-3-3Ab 遺伝子座ABC98646 に由来する。 ホスホグリセリン酸キナーゼ PGK EC2. 3 は、3-ホスホグリセリン酸およびATPから、1,3-ビスホスホグリセリン酸ADPを生成する。 例示的なホスホグリセリン酸キナーゼは、シネココッカス属の種PCC6301に由来する遺伝子座BAD78623である。 グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ GAPDH EC1. トリオースリン酸イソメラーゼ EC5. 1 は、グリセルアルデヒド3-リン酸からジヒドロキシアセトンリン酸 DHAP を生成する。 例示的なトリオースリン酸イソメラーゼは、シネコシスティス属の種PCC6803に由来するtpiA遺伝子、遺伝子座Q59994によってコードされる。 フルクトース-1,6-二リン酸アルドラーゼ EC4. 13 は、DHAPおよびグリセルアルデヒド3-リン酸から、フルクトース-1,6-二リン酸を生成する。 例示的なクラスIIフルクトース1,6-二リン酸アルドラーゼは、シネコシスティス属の種PCC6803に由来する、fbaA遺伝子、遺伝子座BAA10184によってコードされる。 フルクトース-1,6-ビスホスファターゼ EC3. 11 は、フルクトース-1,6-二リン酸およびH20から、フルクトース-6-リン酸およびPiを生成する。 トランスケトラーゼ EC2. 1 は、フルクトース6-リン酸およびグリセルアルデヒド3-リン酸から、キシルロース5-リン酸およびエリトロース4-リン酸を生成する。 ペントース-5-リン酸-3-エピメラーゼ EC5. 1 は、キシルロース-5-リン酸からリボース-5-リン酸を生成する。 セドヘプツロース-1,7-二リン酸アルドラーゼ EC4. 13 は、エリトロース-4-リン酸およびDHAPから、セドヘプツロース-1,7-二リン酸を生成する。 セドヘプツロース-1,7-ビスホスファターゼ SBPアーゼ EC3. 37 は、セドヘプツロース-1,7-二リン酸およびH2Oから、セドヘプツロース-7-リン酸およびPiを生成する。 例示的なSBPアーゼは、コナミドリムシに由来するcsbp遺伝子、遺伝子座CAA52439によってコードされる。 トランスケトラーゼ EC2. 1 は、セドヘプツロース7-リン酸およびグリセルアルデヒド3-リン酸から、リボース-5-リン酸およびキシルロース5-リン酸を生成する。 リボース-5-リン酸イソメラーゼ EC5. 6 は、キシルロース-5-リン酸またはリボース-5-リン酸からリブロース-5-リン酸を生成する。 ホスホリブロキナーゼ EC2. 19 は、リブロース-5-リン酸およびATPから、リブロース-1,5-二リン酸およびADPを生成する。 例示的なホスホリブロキナーゼは、コナミドリムシに由来するprkA遺伝子、遺伝子座AAA33090である。 」 The Plant Journal 2005. 42:504-12]。 例示的なCP12遺伝子は、サーモシネココッカス・エロンガタスBP-1に由来する遺伝子座BAC09372である。 さらに、またはその代わりとして、アセチル-CoAへの炭素フラックスを効率的に下げる内因性遺伝子が下方制御またはノックアウトされる。 これらの態様において、アシルコエンザイムAデヒドロゲナーゼ EC1. 前記のある特定の酵素は、CO2を2-炭素アセチル-CoA 還元的TCAおよびウッド-ユングダール経路 またはグリオキシル酸 3-HPA経路 に同化する経路を提供する。 これらの組み合わせ 優先的に、3-HPA回路および還元的TCA回路 もまた特殊な場合において操作される。 このシナリオでは、CO2固定反応の産生物 アセチル-CoAおよびグリオキシル酸 はグリオキシル酸回路の投入物として用いられ、グリオキシル酸回路は、アセチル-CoAおよびグリオキシル酸を 4-炭素リンゴ酸中間体を介して 4-炭素オキサロ酢酸に結合する[Chung T, Klumpp DJ, Laporte DC. J Bacteriol 1988. 「Glyoxylate bypass operon of Escherichia coli: cloning and determination of the functional map. 」 170 1 :386-92. これらの重要な酵素はグリオキシル酸シャント経路に関与する。 好ましい態様では、CO2固定を最大にするために、全てが過剰発現される。 リンゴ酸合成酵素 EC2. 9 は、アセチル-CoA、水、およびグリオキシル酸からリンゴ酸およびコエンザイムAを生成する。 例示的な酵素は、大腸菌遺伝子座JW3974 aceB によってコードされる。 別の例示的な活性は、大腸菌がコードする代替のリンゴ酸合成酵素、JW2943遺伝子座リンゴ酸合成酵素G glcB によって提供される。 イソクエン酸リアーゼ EC4. 1 は、イソクエン酸からグリオキシル酸およびコハク酸を生成する。 例示的な酵素は、大腸菌遺伝子座JW3975 aceA によってコードされる酵素である。 リンゴ酸デヒドロゲナーゼ EC1. 例示的な酵素は、大腸菌遺伝子座JW3205 mdh によってコードされる酵素である。 糖新生は、生物が、ピルビン酸、乳酸、グリセロール、およびグルコース生成アミノ酸を含む非糖炭素基質からグルコースを生成するプロセスである。 解糖のほとんどの段階は、3つの例外を除いて二方向性である Hers HG, Hue, L. Ann Rev. Biochem 1983. 「Gluconeogenesis and related aspects of glycolysis. 」52:617-53 に概説される。 ある特定の態様において、 糖新生の速度を改善するために、これらの酵素活性が発現される。 ピルビン酸からホスホエノールピルビン酸への変換 ピルビン酸からホスホエノールピルビン酸への変換には、以下の通り2つの酵素活性が必要とされる。 ピルビン酸カルボキシラーゼ EC6. 1 は、ピルビン酸、ATP、およびCO2からオキサロ酢酸、ADP、およびPiを生成する。 例示的なピルビン酸カルボキシラーゼは、サッカロマイセス・セレビシエに由来するYGL062W遺伝子座、pyc1によってコードされる。 ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ EC4. 49 は、オキサロ酢酸およびATPから、ホスホエノールピルビン酸 phosphoenolpyurate 、ADP、Pi、およびCO2を生成する。 例示的なホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼは、大腸菌遺伝子座JW3366、pckAによってコードされる。 フルクトース1,6-二リン酸からフルクトース-6-リン酸への変換 フルクトース1,6-二リン酸からフルクトース-6-リン酸への変換には、フルクトース-1,6-ビスホスファターゼ EC3. 11 が必要とされる。 フルクトース-1,6-ビスホスファターゼは、フルクトース-1,6-二リン酸および水からフルクトース-6-リン酸およびPiを生成する。 例示的なフルクトース-1,6-ビスホスファターゼは、大腸菌遺伝子座JW4191、fbp、 EC#4. 13 によってコードされる。 1 、フルクトースビスホスファターゼIIタンパク質 E. 1 、およびフルクトースビスホスファターゼアルドラーゼタンパク質 E. XXX をコードし、以下のプライマー:fbpIフォワードプライマーおよびリバースfbpIプライマー;fbpIIフォワードプライマーおよびリバースプライマー;fbaAフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて、サーモシネココッカス・エロンガテスBP-1株ゲノムDNAから直接増幅された。 PCR増幅は、PCR SuperMix High Fidelity Invitrogen, Carlsbad, CA および標準的なPCR増幅条件を用いて行った。 fbpIおよびfbpIIフォワードプライマーによりNdeI制限認識部位が付加され、fbaAフォワードプライマーによりBsmAI制限認識部位が付加され、全てのリバースプライマーにより停止コドンおよびEcoRI制限認識部位が付加される。 増幅されたfbpI PCR遺伝子産物、fbpII PCR遺伝子産物、およびfbaA PCR遺伝子産物をpJB5発現ベクターに、周知の実験法を用いてインサートおよびベクターを個々にNdeIおよびEcoRIまたはBsmAIおよびEcoRI New England Biolabs 制限エンドヌクレアーゼで消化することによってクローニングした 「pJB5-fbpI」、「pJB5-fbpII」、「pJB5-fbaA」。 消化物を、公表された技法から逸脱することなく、0. 8%TAEアガロースゲル上でゲル単離し、Gel Extraction Kit Qiagen を用いて精製し、T4 DNAリガーゼ New England Biolabs を用いて連結した。 別々のJCC136調製物を個々に形質転換するために、pJB5-fbpI、pJB5-fbpII、およびpJB5-fbaAプラスミドストックを、Qiagenミニプレップキットを用いて精製した。 pJB5-fbpI形質転換の場合、標的シネココッカス属宿主細胞への組込みは、「コロニーPCR」プロトコールによる全細胞ゲノムDNAのPCRによって確認した。 PCRは、コロニーの正しいバンドを示した。 この株をJCC136-FbpI 図10、パネルB、レーン2 と名付けた。 培養物をOD730nm5. 0またはそれ以上まで増殖させ Molecular Devices Spectramax M2e; OD730nm1は約0. 2まで希釈し戻した。 各時点 希釈後、0時間、24時間、48時間、72時間、および96時間 について約1mLの培養物を採取し、OD730nmを記録した 適宜、読取値が0. 04〜0. 4となるように希釈した。 これは、Spectramax M2eにおいて最も正確な範囲であることが以前に確かめられている。 320mm、フィルム厚:1. エタノールの濃度および光学密度に対して規準化したエタノールを、図11にプロットした。 III. グルコース-6-リン酸からグルコースへの変換 グルコース-6-リン酸からグルコースへの変換には、グルコース-6-ホスファターゼ EC3. 68 が必要とされる。 グルコース-6-ホスファターゼは、グルコース-6-リン酸および水から、グルコースおよびPiを生成する。 例示的なグルコース-6-ホスファターゼは、サッカロマイセス・セレビシエYHR044C遺伝子座、dog1によってコードされる。 別の例示的なグルコース-6-ホスファターゼ活性は、サッカロマイセス・セレビシエYHR043C遺伝子座、dog2によってコードされる。 糖新生の出発物質であるオキサロ酢酸は、グリオキシル酸シャントを介して 還元的TCA経路もしくはウッド-ユングダール経路および3-HPA経路からの投入物を活用する 、またはピルビン酸のカルボキシル化を介して生成される。 グリオキシル酸シャントの非存在下では、ピルビン酸フェレドキシン:酸化還元酵素 EC1. 1 のピルビン酸合成酵素活性によって、アセチル-CoA、CO2、および還元型フェレドキシンから、ピルビン酸、CoA、および酸化型フェレドキシンを生成することができる[Furdui C and Ragsdale SW. Biol. Chem 2000.

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アンタル・ドラティの芸術(75CD)【CD】 75枚組 [ARTIS023]

ロイコロディウム

生態 [ ] 一般に寄生虫というのは、にこっそり隠れており、がこれを気付かず食べることが多い。 しかしロイコクロリディウムは最終宿主に食べられるよう、積極的に中間宿主をに似せるところに特徴がある。 このの卵は鳥の糞の中にあり、カタツムリが鳥の糞を食べることでカタツムリの内に入り込む。 カタツムリの消化器内でして、となる。 さらに中に10から100ほどのを含んだ色鮮やかな細長いチューブ形状の( ブラッドサック broodsac と呼ばれる)へと成長し、カタツムリの触角に移動する。 なお、ブラッドサックは1つの寄生虫ではなく、動かない粒状のセルカリア(幼虫)を多数内包した筋肉の袋にしか過ぎない。 また、この芋虫状のブラッドサックは宿主が死ななければ、多数(10前後)見つかる場合がある。 袋であるブラッドサックは激しく脈動するが、その運動方法や制御方法はまだ分かっていない。 ブラッドサックが触角に達すると、異物を感じたカタツムリは触角を回転させて、その触角が、あたかも脈動するのように見える。 このような動きを見せるのは主として明るい時であり、暗いときの動きは少ない。 また、一般のカタツムリは鳥に食べられるのを防ぐために暗い場所を好むが、この寄生虫に感染したカタツムリは、おそらくが遮られることが影響して 、明るいところを好むようになる。 これをイモムシと間違えて鳥が捕食し、鳥の消化器内で、ブラッドサックからが放出され、成虫であるへと成長する。 つまり、カタツムリは中間宿主であり、鳥が最終宿主である。 ジストマはらしく長く扁平な体をしており、腹にがある。 鳥のに吸着して暮らし、体表から鳥の消化物を吸収してとしている。 が可能だが、でもできる。 鳥の直腸で卵を産み、その卵は糞と共に排出され、またカタツムリに食べられる。 では、の研究によりから L. perturbatum と L. paradoxum が、そしてから未記載種( L. passeri の可能性がある)が発見されている。 種 [ ] ブラッドサックの色彩・模様から種の区別が可能だが、ジストマはほとんど区別がつかないためによる同定が必要である。 ロイコクロリディウムに属する種は次の通り:• caryocatactis Zeder,• fuscostriatum ,• holostomum ,• melospizae• passeri• perturbatum Pojmanska,• vogtianum Baudon,• McIntosh, Urogonimus macrostomus , が L. macrostomumとされることがある。 Leucochloridium paradoxum [ ] ロイコクロリディウム・パラドクサムは19世紀初めにドイツで見つかった。 その後、ノルウェー 、 など各地で見つかっている。 中間宿主はの近縁種。 最終宿主は鳥一般であり、 Taeniopygia guttata から見つかった例がある。 Leucochloridium variae [ ] ロイコクロリディウム・ヴァリアエは北アメリカに住む。 、 、 などで見つかっている。 中間宿主は である。 最終宿主は 、 、 など。 画像 [ ]• Edwin J. Robinson, Jr. December 1947. provis. The Journal of Parasitology 33 6 : 467—475. Wesoowska, T. Wesoowiski,Journal of Zoology October 2013. Journal of Zoology. Issue 292, 2014: 151-5. Animal Diversity Web• 2019 , Volume 72, October 2019• Casey, T. Bakke, P. Cable November 2004. Systematic Parasitology. Volume 56, Number 3: 163-168. Bakke April 1980. Systematic Parasitology, Volume 1, Numbers 3-4. 189-202. Lewis, Jr. and Kelly Beers 1995. Journal of Parasitology, volume 81 1 : 112-114. Michael A. Hnida. 2008. Comparative Parasitology 75 2 :308-314. doi: 10. Bakke, Tor A. 1982. Zoologica Scripta 11 2 :87—100 doi:10. 1463-6409. 1982. tb00521. Hornbach. 1979. Journal of Parasitology 65 3 : 371-374• Fried B. , Beers K. , Lewis PD Jr. 1993 February. Int. Parasitol. 23 1 :129-131. 2010年7月4日, at the.. accessed 12 February 2009. 関連項目 [ ] 宿主の行動を操り、感染を拡大させる細菌など• () - アリに寄生し体を蝕みながら体を操縦し、植物の葉の裏側の太い葉脈に噛り付かせて固定。 頭から後ろに子実体を成長させ、そこから地上にいる他のアリに胞子を付ける菌類• - カマキリやバッタなどに寄生し、体の動きを制御する寄生虫• () - テントウムシをボディーガードとして操作する• - 全ての哺乳類に感染し、罹患することで攻撃性が増す場合があり、その動物が噛んだり舐めたりすることで感染を拡大する。 ・ - くしゃみ・咳を誘発し、飛沫感染によって感染を拡大する。 外部リンク [ ]• Paul D. Lewis, Jr. - The Journal of Parasitology, Vol. 60, No. 2 Apr. , 1974 , pp. 251-255• - の記事•

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ロイコクロリディウム

ロイコロディウム

生態 [ ] 一般に寄生虫というのは、にこっそり隠れており、がこれを気付かず食べることが多い。 しかしロイコクロリディウムは最終宿主に食べられるよう、積極的に中間宿主をに似せるところに特徴がある。 このの卵は鳥の糞の中にあり、カタツムリが鳥の糞を食べることでカタツムリの内に入り込む。 カタツムリの消化器内でして、となる。 さらに中に10から100ほどのを含んだ色鮮やかな細長いチューブ形状の( ブラッドサック broodsac と呼ばれる)へと成長し、カタツムリの触角に移動する。 なお、ブラッドサックは1つの寄生虫ではなく、動かない粒状のセルカリア(幼虫)を多数内包した筋肉の袋にしか過ぎない。 また、この芋虫状のブラッドサックは宿主が死ななければ、多数(10前後)見つかる場合がある。 袋であるブラッドサックは激しく脈動するが、その運動方法や制御方法はまだ分かっていない。 ブラッドサックが触角に達すると、異物を感じたカタツムリは触角を回転させて、その触角が、あたかも脈動するのように見える。 このような動きを見せるのは主として明るい時であり、暗いときの動きは少ない。 また、一般のカタツムリは鳥に食べられるのを防ぐために暗い場所を好むが、この寄生虫に感染したカタツムリは、おそらくが遮られることが影響して 、明るいところを好むようになる。 これをイモムシと間違えて鳥が捕食し、鳥の消化器内で、ブラッドサックからが放出され、成虫であるへと成長する。 つまり、カタツムリは中間宿主であり、鳥が最終宿主である。 ジストマはらしく長く扁平な体をしており、腹にがある。 鳥のに吸着して暮らし、体表から鳥の消化物を吸収してとしている。 が可能だが、でもできる。 鳥の直腸で卵を産み、その卵は糞と共に排出され、またカタツムリに食べられる。 では、の研究によりから L. perturbatum と L. paradoxum が、そしてから未記載種( L. passeri の可能性がある)が発見されている。 種 [ ] ブラッドサックの色彩・模様から種の区別が可能だが、ジストマはほとんど区別がつかないためによる同定が必要である。 ロイコクロリディウムに属する種は次の通り:• caryocatactis Zeder,• fuscostriatum ,• holostomum ,• melospizae• passeri• perturbatum Pojmanska,• vogtianum Baudon,• McIntosh, Urogonimus macrostomus , が L. macrostomumとされることがある。 Leucochloridium paradoxum [ ] ロイコクロリディウム・パラドクサムは19世紀初めにドイツで見つかった。 その後、ノルウェー 、 など各地で見つかっている。 中間宿主はの近縁種。 最終宿主は鳥一般であり、 Taeniopygia guttata から見つかった例がある。 Leucochloridium variae [ ] ロイコクロリディウム・ヴァリアエは北アメリカに住む。 、 、 などで見つかっている。 中間宿主は である。 最終宿主は 、 、 など。 画像 [ ]• Edwin J. Robinson, Jr. December 1947. provis. The Journal of Parasitology 33 6 : 467—475. Wesoowska, T. Wesoowiski,Journal of Zoology October 2013. Journal of Zoology. Issue 292, 2014: 151-5. Animal Diversity Web• 2019 , Volume 72, October 2019• Casey, T. Bakke, P. Cable November 2004. Systematic Parasitology. Volume 56, Number 3: 163-168. Bakke April 1980. Systematic Parasitology, Volume 1, Numbers 3-4. 189-202. Lewis, Jr. and Kelly Beers 1995. Journal of Parasitology, volume 81 1 : 112-114. Michael A. Hnida. 2008. Comparative Parasitology 75 2 :308-314. doi: 10. Bakke, Tor A. 1982. Zoologica Scripta 11 2 :87—100 doi:10. 1463-6409. 1982. tb00521. Hornbach. 1979. Journal of Parasitology 65 3 : 371-374• Fried B. , Beers K. , Lewis PD Jr. 1993 February. Int. Parasitol. 23 1 :129-131. 2010年7月4日, at the.. accessed 12 February 2009. 関連項目 [ ] 宿主の行動を操り、感染を拡大させる細菌など• () - アリに寄生し体を蝕みながら体を操縦し、植物の葉の裏側の太い葉脈に噛り付かせて固定。 頭から後ろに子実体を成長させ、そこから地上にいる他のアリに胞子を付ける菌類• - カマキリやバッタなどに寄生し、体の動きを制御する寄生虫• () - テントウムシをボディーガードとして操作する• - 全ての哺乳類に感染し、罹患することで攻撃性が増す場合があり、その動物が噛んだり舐めたりすることで感染を拡大する。 ・ - くしゃみ・咳を誘発し、飛沫感染によって感染を拡大する。 外部リンク [ ]• Paul D. Lewis, Jr. - The Journal of Parasitology, Vol. 60, No. 2 Apr. , 1974 , pp. 251-255• - の記事•

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